分子生物学实验 - 图文 下载本文

上图为菌落的PCR电泳结果,中起靠右的第一条带为MArKER,其余为菌落的PCR结果,分析上图可知,个别组未产生条带,主要由于菌落挑取不足或失败,从而导致缺少DNA,故PCR扩增后无产物。

上图为GFP绿色荧光蛋白图,绿色荧光蛋白(GFP)基因来自海底生物多孔水母,该基因表达产物在紫外光照射下可发出绿色荧光。现已将该基因克隆到阿拉伯糖启动子驱动的原核表达pGLO中,通过阿拉伯糖的诱导,可使该基因在细菌中进行表达。

植物基因组DNA提取,酶切及电泳

一、目的

掌握植物基因组DNA提取的一般方法及注意事项。大分子量DNA分子的酶切分析。

二、原理

十六烷基三甲基溴化胺(CTAB)是一种去污剂,可溶解细胞膜,它能与核酸形成复合物,在高盐溶液中是可溶的,当降低溶液盐浓度到一定程度时,从溶液中沉淀。在本实验方案中,首先通过含有CTAB高盐抽提液使DNA充分溶出,然后加入氯仿使蛋白和细胞碎片沉淀,离心后,溶液分为三层,上层为CTAB与核酸的复合物的高盐溶液,中层为蛋白质和细胞碎片,下层为氯仿。取出上清加入异丙醇使核酸沉淀。

由于CTAB能溶解于乙醇,在洗涤过程中CTAB即可被除去。

三.步骤

(一)基因组DNA提取

1、取0.15g左右小麦叶片,在液氮中研磨后放入1.5ml离心管中,加入700μl抽提液(65℃预热)混匀,放入65℃水浴中,裂解40-60分钟,期间温和混匀几次。

2、取出裂解好的DNA ,加入700μl 氯仿:异戊醇(24:1),猛烈混匀,离心(10000rpm,10分钟)。

3、取上清于新管中,(不要混入氯仿),加入0.8-1倍预冷异丙醇,缓慢混匀后,再猛烈混匀,使DNA成团,-20℃放置半小时以上。

4、将析出的DNA 离心,14000rpm,10分钟。

5、去掉上清,将沉淀用1ml 70% 乙醇清洗一次,离心干燥,溶于50μl TE或水中。 (二)酶切及电泳分析

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1、按照下表加入各成分。 管号 λ基因组DNA/μg 植物基因组DNA EcoRⅠ/ ul EcoRⅠBuffer(10×) Hind III / ul Hind III Buffer(10×) ddH2O/ ul RNA酶 ① 1 1 2 26 ② 1 1 2 26 ③ 10 2 5 13 ④ 10 2 5 13 ⑤ 10 2 5 2 5 6 ⑥ 10 2 5 2 5 5 1 37℃反应4h,迅速加入2 ul EDTA 中止反应。0.8%琼脂糖凝胶电泳(样品全部点样)

1、 10000rpm离心20 S混匀,37℃反应4h。 2、 0.8%琼脂糖凝胶电泳(样品全部点样)。 3、 观察并记录结果。 四.结果分析

植物基因组DNA酶切结果

PCR结果

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由植物基因组DNA酶切结果可以看出,左起第三条带酶切结果显著,图中部分条带见出现了空区域,可能是点样过程中遗漏所致.

在PCR图中,第一排中起第一条带为Marker,倒数第三条带最亮,酶切最为成功; 第二排中每条带中央亮条带为扩增产物,而下方较暗的条带则为RNA.

植物RNA提取,电泳及PT—PCR扩增

一、目的

1.掌握RNA提取的基本技术,了解RNA提取过程中的各种注意事项。 2.学习从细胞或组织的RNA中用逆转录PCR扩增目的基因的技术及操作。

二、原理

1. RNA提取

RNA提取是分子生物学实验中难度较大的实验技术。

RNA提取和DNA提取有类似的地方,因为它们都是核酸,都具有较好的水溶性。提取RNA首先破碎细胞,然后用提取液将RNA溶出,反复抽提去除蛋白质,加入乙醇沉淀RNA,将RNA沉淀溶解备用。那么如何区分DNA和RNA分开?DNA和RNA的溶解性不同,DNA在1M的盐溶液中具有最好的溶解度,而RNA在0.14M的盐溶液中具有最好的溶解度,所以可以利用它们的溶解性将它们进行区分。另外,RNA的分子量一般比较小,而DNA分子很大且和蛋白结合成复合体,所以DNA更容易随蛋白沉淀,而RNA具有较好的溶解性。 RNA提取的另一个关键问题就是如何抑制或去除环境中RNA酶。所有的玻璃、陶瓷和铁器具在180℃×6 h以上。所有的塑料器皿用0.1%的DEPC水37℃过夜浸泡,然后湿热灭菌80℃烘干备用。配制溶液所需的水也要用DEPC处理过的水,而配置Tris相关的缓冲液时Tris会与DEPC发生反应,应避免用DEPC处理。另外操作过程中应戴手套。 判断RNA 的质量主要有两个标准,一是纯度,二是完整性(是否被降解)。RNA的纯度可以通过分光光度计进行测定的A260/A280值来判断。RNA的完整性主要通过电泳分析来阐明,未降解的总RNA电泳时在凝胶中会出现18S和28SrRNA对应的条带(如果有DNA污染则在RNA后会发现基因组DNA对应的条带)。RNA电泳系统也要严格对RNA酶进行处理。如果用普通琼脂糖凝胶电泳,则用尽量减少电泳时间。

2. RT—PCR

普通PCR方法可以以DNA为模板扩增基因,但真核生物的基因组中通常分为可转为mRNA的外显子和不转录的成mRNA的内含子,所以从染色体DNA用PCR方法扩增出的基因是内含子和外显子相间排列的DNA分子,不能用于基因工程的直接表达。如果用人工的方法把内含子去除,是极其烦琐费力的事。逆转录PCR利用逆转录病毒依赖于RNA的DNA逆转录合成酶,在反义引物或oligo(d T)的引导下合成mRNA互补的DNA(complemental DNA),再按普通的PCR的方法用两条引物以cDNA为模板,扩增出不含

,,

内含子的可编码完整蛋白的基因。这一DNA的5和3端经改造可直接用于基因工程的表达,因此逆转录PCR成为了目前获取目的基因的一条重要途径。

三.步骤

RNA提取

1、取植物叶片1-3克,放在液氮中磨成粉末。(可以多研磨一些,然后分装,小

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量提取试剂量可减至1/10)

2、液氮挥发完之前,倒入含有10 毫升RNA提取液的离心管中,迅速反复倒置混匀,直至看不见任何团状物为止。

3、立即加入10毫升的等体积(酸性)酚/氯仿,剧烈(!)反复倒置混匀5至10min(如在震荡器上震荡,要确保混匀而不能仅仅是振动!)。

4、13000g×5min,吸管取上清(注意避免吸取界面上的蛋白)。 5、重复步骤3和4,三次左右(注意观察界面上白色物质)。 6、取上清,加入等体积的氯仿,反复倒置混匀2-5min。 7、13000g×5min。 8、取上清,加入1/3体积8 M 的 LiCl (即8 M LiCl应占最后体积的25%), 沉淀RNA,4℃过夜。

9、离心13000g × 10 min。

10、弃上清,保留沉淀(此时应把RNA沉淀转入Eppendorf管中,以便于操作), 加入70%无水乙醇+30% 0.5 M NaCl 的混合液0.5 毫升洗涤沉淀数分钟(和缓地反复倒置混匀),离心 (13000g × 2 min)。重复洗涤沉淀数次。

11、用70%乙醇再洗涤2次沉淀,去掉盐离子。 12、用枪头吸去残留的液体,真空干燥2min。 13、加入200 ul DEPC 处理过的水溶解RNA。

14、取用5 ul电泳检测RNA完整性, 用TEB 缓冲液, 200V× 20-30min。 15、取5 ul稀释40倍测定RNA纯度和浓度,A260 /A280 应在 2.0 左右。 16、将RNA 分装,放在-70℃长期保存备用. 辅助方案:试剂盒提取法(Trizol) (一)试剂:

1.Ttizol Reagent

2.氯仿 3.异丙醇

4.70%无水乙醇 5.DEPC (二)器材:

1、 研钵 2、 离心机 (三)实验步骤

1、 称取小麦叶片50-100mg,于研钵中加液氮研磨成粉末,迅速转移到1.5ml离

心管中。

2、 加入1 ml Trizol Reagent,15~30℃×5min。 3、 加入0.2ml氯仿,剧烈振荡15 sec,15~30℃×3min。 4、 冷冻离心12 000 rpm×15min。

5、 将上清液转移到另一个离心管中,加0.5ml预冷异丙醇,混匀 ,-20℃放置

20min。

6、 冷冻离心12 000 rpm×10min。

7、 加入0.5ml 70% 乙醇洗RNA沉淀,悬浮,7500 rpm×2min,除去乙醇。 8、 加入30 ul DEPC 处理过的ddH2O溶解RNA。

PT—PCR扩增

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