实验一 过氧化氢酶Km的测定

【原理】

本实验测定红细胞中过氧化氢酶的米氏常数。过氧化氢酶(CAT)催化下列反应：

化氢酶2H2O2?过氧?????2H2O+O2↑

H2O2浓度可用KMnO4在硫酸存在下滴定测知。

?? 2MnSO4＋K2SO4＋5O2↑＋8H2O 2KMnO4＋5H2O2＋3H2SO4 ? 求出反应前后H2O2的浓度差即为反应速度。作图求出过氧化氢酶的米氏常数。 【试剂】

1．0.05mol/L草酸钠标准液 将草酸钠（AR）于100～105℃烘12h。冷却后，

准确称取0.67g，用水溶解倒入100ml量瓶中，加入浓H2SO4 5ml，加蒸馏水至刻度，充分混匀，此液可贮存数周。

2．约0.02ml KMnO4储存液 称取KMnO4 3.4g，溶于1000ml蒸馏水中，加热搅拌，待全部溶解后，用表面皿盖住，在低于沸点温度上加热数小时，冷后放置过夜，玻璃丝过滤，棕色瓶内保存。

3．0.004mol/L KMnO4应用液 取0.05mol/L草酸钠标准液20ml，于锥形瓶中，加浓H2SO4 ml，于70℃水浴中用KMnO4贮存液滴定至微红色，根据滴定结果算出KMnO4贮存液的标准浓度，稀释成0.004mol/L，每次稀释都必须重新标定储存液。

4．约0.08mol/L H2O2液 取20%H2O2（AR）40ml于1000.0ml量瓶中，加蒸馏水至刻度，临用时用0.004mol/L KMnO4标定之，稀释至所需浓度。 5．0.2mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.0）。 【操作步骤】

l．血液稀释 吸取新鲜（或肝素抗凝）血液0.1ml，用蒸馏水稀释至10ml，混匀。取此稀释血液1.0ml，用磷酸盐缓冲液(pH7.0，0.2mol/L)稀释至10ml，得1：1000稀释血液。

2．H2O2浓度的标定：取洁净锥形瓶两只，各加浓度约为0.08mol/L的H2O2 2.0ml和25%H2SO4 2.0ml，分别用0.004mol/L KMnO4滴定至微红色。从滴定用去KMnO4ml数，求出H2O2的mol浓度。

3．反应速度的测定：取干燥洁净50ml锥形瓶5只，编号，按下表操作。 加入物(ml) H2O2(约0.08mol/L)

蒸馏水

1 0.50 3.0

2 1.00 2.50

3 1.50 2.00

4 2.00 1.50

5 2.50 1.00

将各瓶置37℃水浴预热5min，依次加入1：1000稀释血液每瓶0.5ml，边加

边摇，继续保温准5min，按顺序向各瓶加25%H2SO4 2.0ml，边加边摇，使酶促反应立即终止。

最后用0.004mol/L KMnO4滴定各瓶至微红色,记录KMnO4消耗量(ml)。 【计算】

1．反应瓶中H2O2浓度(mol/L)?H2O2 mol浓度?加入H2O2ml数H2O2 mmol数 ?44 （式中：4为反应液量4ml） 2．反应速度的计算：以反应消耗的H2O2 mmol数表示。 反应速度=加入的H2O2 mmol数－剩余的H2O2 mmol数

即：H2O2 mol浓度×加入的毫升数－KMnO4 0.004 mol/L×消耗的KMnO4毫升数× 5/2 （式中：5/2为KMnO4与H2O2反应中mol换算系数） 3．求Km值：

下面引用一次实验结果为例，求过氧化氢酶的Km值，供计算参考。

己知KMnO4为0.004mo1/L，标定出H2O2浓度为0.08mol/L，列表计算如下：

计算程序

①加人H2O2数

②加人H2O2mmol=①×0.08 ③底物浓度［S］=②÷4 ④酶作用后，KMnO4滴定ml

1 0.50 0.04 0.01 1.35

2 1.00 0.08 0.02 3.70 0.037 0.043

3 1.50 0.12 0.03 6.40 0.064 0.056

4 2.00 0.16 0.04 9.80 0.098 0.062

5 2.50 0.20 0.05 13.20 0.132 0.068

⑤剩余H2O2mmol=④×0.004×5/2 0.0135 ⑥反应速度V=②一⑤

0.0265

⑦[S]/V=③÷⑥ 0.377 0.465 0.536 0.645 0.735

按前述方法作图求得Km＝0.032mol/L。 【思考题】

l．Km值的意义是什么？

2．测酶Km值的实验中，需要特别注意哪些操作？