胺基树脂柱使用维护指南手册

目 录

1树脂色谱柱的介绍 2柱子结构 2.1拆箱

2.2 清洗液的制备 3 柱子的保护 3.1安装指南 3.2 清洗指南 4 固定相 5 操作参数 5.1 流速 5.2 样品分离 5.3 压力控制 5.4 测试 6 再生步骤

6.1树脂床蓬松 6.2清洗污染的柱子

6.3 柱子恢复到原始离子状态 6.4

6.5仪器调整/ 连接管道问题 7 加热柱关闭 8柱子保存

8.1 长期保存 8.2 短期保存 9 故障检修

第一部分：

树脂基HPLC（高效液相色谱）色谱柱介绍

树脂基HPLC色谱柱依据离子排斥、离子交换、配体交换、粒度排斥、反相和正相分配原理。多重模式和交互作用提供了分离物质的独特的能力。树脂的装填使柱子有离子交换的能力。聚苯乙烯的骨架提供了疏水的相互作用。相互作用的程度取决于待分析的化合物和要求的选择性程度。

要达到有效分离，反相和离子对HPLC技术要求复合洗脱剂条件。这些方法建立在待分析化合物的改性上，直到对柱子适合为止。对于树脂基的HPLC柱，可以通过改变填充的材料及优化色谱条件实现化合物的分析。因此，树脂基柱也可用于异构体的HPLC体系，简化样品的制备方法，同时要求样品没有衍生作用。通过缩短样品的制备时间，树脂基柱大大缩短了总的分析时间，但是对于大部分的分离，样品制备时必须进行过滤。

柱子是高效液相色谱的核心。分析的成功与否取决于合适的操作条件选择及柱子的维护保养，不管HPLC系统及样品的制备多么好，如果柱子的使用不当，也得不到好的分离结果。

第二部分：色谱柱结构 2.1拆包

拆包取色谱柱时，仔细检查是否有运输过程中的损害，粗处理或者溶剂泄漏。使用运输过程中的箱子存放柱子。如果发现柱子被损坏的迹象，立即通知运输方，并且联系Bio-Rad公司技术服务部或直接去Bio-Rad公司在当地的办事处。

2.2 准备洗脱液（也就是流动相）

只有新的去离子水、分析纯试剂和高纯度有机溶剂可以用来制备洗脱液。制备好的流动相在使用之前需用0.45μm的过滤器进行过滤以除去可以堵塞系统进口的不溶性微粒。而基线不稳常常是由于流动相不干净引起的。使用前对洗脱液进行充分的脱气处理。

使用真空和超声处理是对流动相进行脱气的最好的方法。仅使用真空脱气也可以，但需要的时间较长。在真空瓶内装有搅拌棒对于溶剂中气体的脱除很有帮助。单纯的过滤并不能除去所有的气体。用来对溶剂进行脱气的瓶子也可用存放溶剂。使用1升的吸滤瓶就可以了。将脱气后的溶剂倒入另一个容器的过程中会使洗脱液中再次混入气体。更换水溶液和有机溶剂过程中进行也可能引起除气。操作前一定要确定两种溶剂均进行了充分的脱气处理。

第3部分 保护柱

对色谱柱的保护成为公认的HPLC技术的一部分已经有很多年了，这是因为它对于分析柱和色谱系统的保护起着重要的作用。Micro-Guard 室不但可以延长分析柱的寿命，还可以保护柱内的样品。影响分离、污染分析柱的的污染物可以在预柱中除去。

由于阴离子、阳离子、有机物、不溶物和微粒引起的可能对分析产生的影响可以使用预柱消除。Bio-Rad公司强烈建议使用预柱。

高效液相色谱柱保护系统包括可处理的安装在标准保护架上的保护室，或者双重的去灰支架的阴离子或阳离子小室。去灰支架在HPX-42A银铵基柱上使用。去灰形式可以在其他使用水为流动相的柱子上使用。

保护柱必须在污染物扩展到分析柱上之前更换。更换频率并没有规定，因为这依赖于样品制备条件。一般的，柱子应该定期用标准样进行检查。发现分析数据发生变化时应更换保护柱。

3.1安装保护柱

安装保护柱管，拧松支架末端的螺母。使用Parker式 小室开始使用时可以在任何一个方向使用，改变用过的小室的方向可能导致微粒从小室中流出污染分析柱。小室支架到HPLC柱之间连接一断管前移量（参见小室支架介绍）。将保护柱安装到固定支架上，使用两末端螺母紧固确保固定支架的指状梁紧固。额外的紧固是不需要的，这还有可能破坏焊封或支架。不要使用其他仪器紧固焊封。

3.2 吹洗保护柱

使用10～15ml流动相以0.2～0.3ml/min的流速通过保护柱，对于树脂基色谱柱，在开始的一小段时间内，柱末端流出黄色的液体是正常的。这是储存柱子时形成的磺酸盐聚合物。安装新柱子时需重复此操作。此时，分析柱可以安装到预柱上。

第四部分:连接色谱柱

将流速降低到0.2ml/min。移走分析柱末端的螺母，将保护柱出口末端与分析柱入口管相连。连接分析柱与泵，调节泵低速转动以排除柱子入口处的空气。色谱柱中流过大约20ml脱气流动相后停止。当一个新柱子连接到色谱系统使用或测试时，通过流动相时，柱子仅需连接进口末端。这样可以阻止填料粒子或气泡进入到检测池。当柱子出口末端流出清洁、无气泡的液体时，柱子出口就可以与检测池相连了。

色谱柱和监测池之间的连接管尽可能短这一点是很重要的。注射器和色谱柱、色谱柱和检测池之间的连接管内径（直径）应为0.01英寸。 确保正确的提供、收集以及处理废弃的溶剂。检查保护柱和分析柱连接处无泄漏后，将填充物正确的安装后，将色谱柱放到Bio-Rad柱预热器（目录号：125-0425）。打开色谱加热器开关调节到合适的温度。无流动相流动时不要开色谱加热。只要达到设定的温度后就可以提高流速了。用洗脱液平衡柱子，用开始的洗脱液倾斜柱子。

注意柱中不能进入空气。如果确定柱中已经混入空气，降低柱温，反方向旋转柱子，使得溶剂缓慢流过柱子直到空气完全除去。确定系统所有管路的空气被排净后重新正确的连接柱子。

需注意的一点是所有金属管连接均用压紧螺钉（反相螺母）。金属垫圈被永久的逆着管子压紧。确保系统的死体积最小，拧紧装配管、垫圈和nut finger tight。向里推动管子直到末端固定。用1/4’’ 扳手拧紧1/4转。零件只有密封时需要拧的足够紧；若拧的过紧则会减少零件的使用寿命。

第五部分：操作参数

此时，高效液相色谱系统应该在先后用合适的流动相、启动溶剂进行清洗。保护柱以及分析柱均等量处理。流速应该为0.2ml/min。

5.1 流速

缓慢、倾斜的流过氨基柱。只有当柱温上升到操作温度后才可以提高流速。当使用碳水化合物铵基柱时（HPX-87C，HPX-87P，HPX-87N），在接近环境温度时流速不可高于0.3ml/min。首先，在维持较低流速的时候加热柱子，然后，在柱温达到指定的操作温度后，提高流动相的流速。注意不要超过柱子限定的最高流速。但是即使这样，为延长柱子的使用时间，不可以在最大流速下操作。在公开发表的方法中有最佳流速的选择方法，流速也可以依据分离要求而定。很多时候，降低流速可以提高分离度。典型的，使用300mm长的（30cm）氨基柱，当柱后压低于最高水平时，最佳的操作流速为0.5～0.7ml/min。随着使用时间的延长，因此使用柱后压做为确定流速的主要确定因素。对于HPX-87C，HPX-87H和其他HPX-87系列柱来说，标准的流速为0.6ml/min。

5.2 样品制备

由于样品中某些组分可能在某些溶剂中可能不溶，为防止这类问题的出现，经常将样品溶解于流动相中，样品溶液需经过0.45μm的过滤器过滤。

5.3 柱压检查

HPLC泵压范围应该进行调整，因为压力提高（压力高于标准值10～20％）将引起泵的自动关闭。这样可以在偶然压力升高情况下保护系统。某些HPLC泵的传感器在需要的低压下不能调整，在这种情况下，需要额外的维护以确保没有超过压力限制范围。

压力在正常流速下会缓慢升高（1-2分钟）。这种方法在柱上gentle，提供最大寿命且维持分离度和效率。柱子开始使用时全流速使用可以压紧填料并且在进口处产生空白，这将降低柱效。

当柱子首次与HPLC系统相连时，在缓慢运转后的正常流速下操作时需检查压力。系统整体反压力大概为700-1100psi。（注释：一些HPLC泵并没有给出低压下精确的压力数；进样器）。为确定柱后压，参看系统操作压力，断开保护柱和分析柱，看其压力降。压降应该在100-200psi。（注释：在重新连接柱子时，应将泵流速降低，然后在1-2分钟后慢慢调至全流速运转）

如果在使用过程中系统整体压降升高（在洗脱过程中使用高浓度溶剂，引起压降超过正常值），重复上述过程以确定引起这种现象的原因。如果由于保护柱的原因，背压升高很小，系统可以正常操作。如果保护柱压力升高超过新柱压力的150％，应该更换保护柱。

如果系统压力升高是由于柱子的原因，则柱子可能有一部分堵塞了，流速应该减低在操作限制范围内。有时候，背压升高是由于经过长时间的注射样品后，非极性化合物在柱上的吸附量达到最大值。有时候，柱压由于物料块堵塞柱子也会升高。在任何情况下，对柱子进行清洗或反相流动可以降低背压。如果保护系统在适当位置，且小室根据方向改变，污染物吸附的越少，柱子使用过程中背压升高的时间出现的越晚。不要以打开柱子的方法解决背压问题。打开后柱子中的填充相可能会被冲压损坏柱子。