微生物检验技术考试要点(整理-中级) 下载本文

病原鉴定:生物特性是具有大量高活性的尿素酶,迅速分解尿素,氧化酶+、触酶+,具有碱性磷

酸酶、r-谷氨酰转肽酶活性,硝酸盐还原+,可生长于5%甘氨酸、0.04%氯化三苯四氮唑培养基中,三糖铁中不产生硫化氢,微需氧5~8%,37℃生长,25℃和42℃均不生长的G-菌,初次分离要3~4天。

快速检测:尿素呼吸试验---简单快捷,可以特异地诊断HP现症感染,敏感性高。主要采用13C、14C(放射性同位素)标记尿素,13C用于儿童和孕妇。

90.《伯杰系统细菌学分类》的标准:G染特性,形态,鞭毛,芽胞,荚膜,代谢产物。 91. 有芽胞的厌氧菌:只有梭菌属包括83个种。厌氧菌每克粪中高达1012个,标本绝不能被正常菌污染,应尽量避免接触空气。最理想的标本是组织,送到实验室后20~30min内处理完不超过2h。应接种固体和液体两种培养基,应使用预还原培养基,液体培养基应煮沸10min以驱氧并立即冷却。每份标本至少接种三个血平板,置于有氧,无氧,5%~10%CO2环境中培养。厌氧手套箱培养法是迄今最佳厌氧培养仪器之一。

92. 厌氧状态的指示剂有:美蓝和刃天青,无氧时白色,有氧时美蓝蓝色,刃天青粉红色。紫外线下出现荧光也是厌氧菌参考之一,卡那霉素用于梭杆菌与类杆菌的区分,甲硝唑用于厌氧菌和非厌氧菌的区别。气液相色谱已成为鉴定厌氧菌及其分类比较可靠的方法。

93. 破伤风杆菌:鼓槌状,早期培养G+,48h后特别是芽胞形成后G-,的O和H抗原,主要症状为骨骼肌痉挛,不发酵糖类,能液化明胶产H2S。产生两种外毒素:破伤风溶血素、破伤风痉挛毒素

94. 产气荚膜梭菌:G+,20~50℃均能生长,最适为45℃,双层溶血,可分解糖类产酸产气,出现汹涌发酵现象,分5型,主要是A型,外毒素以A毒素为主,本质是卵磷脂酶(α毒素),在蛋黄琼脂平板上菌落周围出现乳白色浑浊圈。所致疾病为气性坏疽,有捻发感,青霉素为首选,万古为次选。

95. 肉毒梭菌:G+,芽胞胶囊于次极端呈汤匙状或网球拍状,严格厌氧,8型,以A,B多见,毒素不耐热,1min煮沸即死。

96. 无芽胞厌氧菌是一大类正常菌群,引起感染是内源性感染。

97. 白喉棒状杆菌:为放线菌,G+,无荚无芽无鞭无毛,奈瑟(Neisser)染色成黄褐色,一端或两端染成蓝色或深蓝色颗粒即异染颗粒,阿培特(Albert)染色菌体呈蓝绿色,异染颗粒成蓝黑色。

分离培养:棉拭子取咽喉部、鼻腔、皮肤病变部位,血平板,吕氏血清斜面(生长迅速,乳白色,S型,形态典型),哥伦比亚血培养基及亚碲酸钾血琼脂(48小时以上,菌落黑色,筛选鉴别)。白喉毒素是一种毒性强、抗原性强的蛋白质,B-棒状杆菌噬菌体毒素基因(tox+)编码的蛋白质,PCR扩增tox+基因辅助诊断不能确诊。免疫沉淀试验(EleK平板试验)检测产生白喉外毒素,是诊断白喉的关键试验。细菌一般不侵入血,但外毒素可入血引起毒血症,不能立即送检时应浸于无菌生理盐水或15%甘油盐水中。出现各种心肌炎,软腭麻痹是白喉晚期死亡的主要原因。(白喉类毒素、百日咳菌苗、破伤

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风类毒素的混合疫苗DPT)

98. 百日咳鲍特菌:专性需氧,常用包-姜培养基(含青霉素G)细小S银灰色不透明珍珠状菌落,在加血培养基上,周围有狨毛状狭窄溶血环,液体培养基中混浊生长。菌落常S-R相变异,Ⅰ相S型,Ⅱ、Ⅲ相过渡型,Ⅳ相R型。有百日咳毒素,丝状血细胞凝聚素和腺嘌呤环化毒素。细菌不进入血流。临床分为3个期:1、卡他期2、痉咳期3、恢复期。依据菌落性状及凝集试验确诊。抗原有PT、FHA,主要用ELISA方法。可获持久免疫力

咳碟法:包-姜培养基(含青霉素G)置10cm使飞沫直射于培养基上,37℃2-3天

鼻咽拭子法:如不能及时接种可放入0.3毫升PH7.2—7.4的1%蛋白胨生理盐水中2小时内检 99. TBE-Tris硼酸缓冲液,长时间电泳选用。MIC-最小抑菌浓度

101.决定细菌的形态因素:培养基的成份、PH、培养时间、温度。直接观察细菌的超微结构:超薄切片技术、电子显微镜。

102. 芽胞:在80℃水中迅速死亡,在100℃水中能耐受2小时以上,在70%乙醇中能存活20年。高压蒸气灭菌杀死细菌牙芽胞最有效。荚膜的重要功能:抗吞噬。是构成细菌毒力的因素之一。

卫生毒理学

1.外源化学物在体内的生物转运:吸收、分布、代谢、排泄四阶段。

化学毒物在体内的代谢分为两相:Ⅰ反应---氧化、还原、水解;Ⅱ反应---与体内源性物质结合 亚慢性毒性试验目的:最大无作用剂量、最大耐受剂量估测阈剂量。(选用两种种属及啮齿类、非啮齿类,初断乳动物)

慢性毒性试验目的:最小有作用剂量、阈剂量、最大未观察到有害作用剂量(选用两种种属及啮齿类、非啮齿类,初断乳动物)

危害性评价组成:认定、描述、接触评定、特征分析

毒理学试验项目:第一阶段:急性毒性试验。第二阶段:遗传毒性试验。第三阶段:亚慢性毒性试验。第四阶段:慢性毒性试验和致癌试验

GB 19489—2004《实验室生物安全通用要求》分级:危害等级Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ。 生物安全防护水平(BSL-1、2、3、4)。

生物安全柜一级:可保护工作人员和环境。生物安全柜二级:分A1、A2、B1、B2可保护工作人员、环境、样品。生物安全柜三级:

2.普通光学显微镜:最高分辨率0.2um,不能观察细菌的亚结构

3.暗视野显微镜:分辨率0.02-0.04um,载玻片厚度1.0mm、盖玻片0.17 mm 4.荧光显微镜:

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5.滴定管精度为0.2—0.1ml,微量滴定管精度为0.005ml。微量吸管5—1000ul。培养皿分:5、7.5、9、10cm

蛋白质、核酸提取及相关设备

一、蛋白质分离纯化----实验室常用盐析法(硫酸铵)。

核酸纯化----酚、氯仿抽提

制备细胞外膜蛋白----超声波细胞粉碎机。

大多数限制内切酶使用温度37℃,保存温度是-20℃。 二、层析

凝胶过滤法(分子筛层析法)---主要用于蛋白或核酸分离。介质:葡聚糖。过滤中先洗脱的是大分子物质,后小分子物质。原理:纤维素或凝胶介质带电荷不同。 三、检测仪

1、分光光度计及检测物质 检测细菌浓度 测定颜色 检测蛋白 检测核酸 分光光度计 可见分光光度计 可见分光光度计 紫外分光光度计 紫外分光光度计 波长nm 600 450 280 260 比色皿 玻璃 石英 石英 2、紫外透射仪:暗室紫外线下看DNA条带。 3、测序仪:蛋白测序仪---测定氨基酸排列顺序

DNA测序仪---测核苷酸排列顺序。物质是;质粒、噬菌体、PCR产物 4、扩增仪:能做PCR称DNA扩增数 5、酶标仪: 二、电泳类: 用于 原 理 聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE) 蛋白质、核酸分离 用垂直电泳槽,凝胶介质形成立体多孔网状结构,过硫酸铵起催化聚合作用, Tris-甘氨酸缓冲液。分离DNA片段最佳范围5-500bp 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) 琼脂免疫电泳 蛋白分离和鉴定 蛋白分离 聚丙烯酰胺浓度越大,线性分离范围越小。十二烷基硫酸钠作用是解离蛋白,常用蛋白染料--考马斯亮蓝,甘氨酸—缓冲 用琼脂糖作介质。为正交的交变脉冲电场;条带靠近负极为大片段DNA,靠近正极为小片段DNA。DNA染色用溴化乙锭(EB)或硝酸银。(分析大分子物质) 琼脂糖凝胶电泳 核酸分离与纯化 1%琼脂糖作支持介质,有“分子筛”和“电泳”的双重作用。用水平电泳槽,充分分离DNA片段最佳范围200bp-50kb

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脉冲电场凝胶电泳(PFGE) 核酸分离 等电聚焦电泳(IFE) 对流免疫电泳(CIE) 火箭电泳 交叉定量免疫电泳 醋酸纤维膜电泳 变性聚丙烯酰胺凝胶 蛋白质分离 以两性电解质制造凝胶有不同PH,使带不同电荷的多肽在电泳条件下于等电点停留。用聚丙烯酰胺制备等电聚焦电泳凝胶。浓缩效应、分辨率高、重复性好、用时少 测定抗体或抗原 缓冲液是PH8.6巴比妥液,使抗原抗体均带负电,抗原向正泳,抗体电渗作用向负泳。 测抗原量 免疫球蛋白鉴定 单链(DNA或RNA) 片段分离与纯化 四、快速斑点免疫金渗滤法(滴金免疫法):属于常用的胶体金技术。方法是---以硝酸纤维素膜(NC膜)为载体,将试剂和标本滴加在膜上,通过渗滤而逐步反应,全程可于数分钟内完成,阳性在膜上呈红色斑点。基本原理是间接法或夹心法

免疫胶体金技术用于检测:抗原、半抗原、抗体 ATCC是指美国典型培养物保藏中心。

MPS---单核-吞噬细胞系统,又称巨噬细胞系统。

玻片凝集反应---2-3分钟看结果;试管凝集反应---18—24小时看结果;沉淀反应---72小时看结果;补体结合试验(CFT)---30分钟看结果

过滤式微生物采样器根据过滤材料不同有:薄膜过滤器、玻璃纤维过滤器、凝胶过滤器、谷氨酸碱过滤器。

病毒的分子生物学鉴定:病毒核酸和蛋白质测定。蛋白质使用--免疫测定技术、电泳技术、质谱技术;核酸使用—探针技术、杂交技术、聚合酶链反应技术

构建基因组文库,初始DNA长度须在90kb以上。纯化的mRNA在70%的乙醇中可保存1年以上。绝大多数Ⅱ类限制酶识别长度为4或6个核苷酸。

为获得条带清晰的DNA电流图谱DNA用量为0.5—1.0ug.

在酶切图谱制作过程中,分离鉴定和纯化DNA片段的标准方法---聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、琼脂糖凝胶电泳。

普通水平电泳制备染色体DNA酶切图谱时,DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系,分离<0.5kb DNA片段所需胶浓度是1.2%-1.5%,分离>10kb DNA片段所需胶浓度是0.3%-0.7%,在低电压时,线状DNA片段的迁移率与所加电压成正比,电压增加,琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使>2kb DNA片段的分辩率达到最大,所加电压不得超过5V/cm。

细菌的培养技术

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