Western Blot
Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄（NC）膜或聚偏二氟乙烯（PVDF）膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术广泛应用于检测蛋白水平的表达。
流程：蛋白样品的提取→蛋白样品定量与变性→PAGE凝胶电泳→转膜→丽春红染色→封闭→抗体孵育→底物显色。
实验器材和试剂：
一． 蛋白提取试剂
1.10% SDS裂解液：
称取10g SDS粉末加入双蒸水至90mL，充分溶解，定容至100ml室温保存。 2.RIPA裂解液
1ml裂解液工作液配方： 10ul 100mmol/L PMSF (1mM) 0.2ul 10mg/ml Aprotinin (2ug/ml) 5.0ul 1mg/ml Leupeptin (5ug/ml)
试剂盒RIPA 0.9848ml 裂解液
0.5ml裂解液工作液配方： 5ul 100mmol/L PMSF (1mM) 0.1ul 10mg/ml Aprotinin (2ug/ml) 2.5ul 1mg/ml Leupeptin (5ug/ml)
0.4924ml 裂解液 PMSF必须摇匀至无结晶时才可与裂解液混合
3．蛋白酶抑制剂：100mmol/L PMSF：
17.4mg PMSF粉末溶于1ml异丙醇(AR)，分装250ul每管后－20℃保存。使用终浓度为1 mmol/L。【PMSF：在溶液中不稳定，应在临用前从储存液中现加于裂解液中。PMSF剧毒，严重损害呼吸道粘膜、眼睛及皮肤，吸入、吞进或通过皮肤吸收后有致命危险一旦眼睛或皮肤接触了PMSF，应立即用大量的水冲洗。凡被PMSF污染的衣物应予丢弃。】
二． 蛋白定量试剂： 1. BCA蛋白定量试剂盒
2. 10ml 0.9%的生理盐水（90mg NaCl溶于10ml去离子水中） 三． 上样用试剂： 6×SDS上样缓冲液：
取一个离心管，秤取2.0g SDS粉末，6mg溴酚蓝(BromopHenolblue;Albutest)粉末，然后用枪头加入5mL 1.5mol/L Tris-HCl (pH 6.8)，用移液管加入10mL Glycerol(甘油，丙三醇)，枪头加入2mL β-mercapteethanol（β-巯基乙醇）充分混匀，加双蒸水定容至20ml，涡旋溶解。4℃避光保存。
四． 电泳工作液：
1. 1.5mol/L Tris-HCl缓冲液：（三（羟甲基）氨基甲烷）
称取18.171g Tris粉末，加入60mL 双蒸水中，加盐酸调节pH至6.8或8.8，定容至100mL。4℃保存。可致癌，不要直接接触皮肤。 2. 1.0mol/L Tris-HCl缓冲液：
称取12.114g Tris粉末，加入60mL 双蒸水中，加盐酸调节pH至6.8或8.8，定容至100mL。4℃保存。可致癌，不要直接接触皮肤。 3. 0.5mol/L Tris-HCl缓冲液： 称取6.057g Tris粉末，加入60mL 双蒸水中，加盐酸调节pH至6.8或8.8，定容至100mL。4℃保存。可致癌，不要直接接触皮肤。 4.10% APS：(一周内使用，最好新鲜配置)
称取0.5g APS粉末，加入双蒸水至5 mL，充分溶解，4℃保存。
5.10% SDS:
秤取10g SDS粉末溶于100ml双蒸水中，可50℃水浴下溶解，室温保存。如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用
5.分离胶（下层胶）： 分离胶 5% 30% acrylamide/bis 1.68ml 1.5mol/L Tris-HCl (pH 8.8) 2.5ml 10% SDS 100ul DdH2O 5.47 10%APS（灌胶时再加） 50μL TEMED（灌胶时再加） 5ul 分离蛋白分子量 57-212KD 6. 4%浓缩胶（上层胶）：
0.7mL 30% Acr/Bis；
7.5% 2.5ml 2.5ml 100ul 4.65ml 50μL 5ul 36-94KD 10% 3.35ml 2.5ml 100ul 3.8ml 50μL 5ul 20-80KD 12% 4.02ml 2.5ml 100ul 3.13ml 50μL 5ul 12-60KD 15% 5ml 2.5ml 100ul 2.15ml 50μL 5ul 10-43KD 混匀后在室温下静置15min，然后加入5ul TEMED即为分离胶，即可灌胶。
1.5mL 0.5mol/L Tris-HCl (pH 6.8)； 60μL 10% SDS；
3.6mL双蒸水混匀后加入50μL 10% APS和5μL TEMED（灌胶时再加）。
7.1×电泳液缓冲液（使用液）（PH=8.3）：
3.04 g Tris粉末，14.4g甘氨酸（Glycine）粉末，1g SDS粉末溶于800ml双蒸水中，调PH=8.3，用ddH2O定容至1000ml，室温保存。可重复使用3-5次。
10×电泳液缓冲液（储存液）（PH=8.3）：
30.4 g Tris粉末，144g甘氨酸（Glycine）粉末，10g SDS粉末溶于800ml双蒸水中，调PH=8.3（浓HCl调），用ddH2O定容至1000ml，室温保存。 五． 转膜工作液：
1×转膜液缓冲液（使用液）（PH=8.3）：
3.0 g Tris粉末，14.1g甘氨酸（Glycine）粉末，1.25g SDS粉末溶于800ml双蒸水中，用ddH2O定容至1000ml，溶解后室温保存，使用时再加250mL甲醇(AR)可重复使用3-5次。
10×转膜液缓冲液（储存液）（PH=8.3）：
30.0 g Tris粉末，141g甘氨酸（Glycine）粉末，12.5g SDS粉末溶于800ml双蒸水中，用ddH2O定容至1000ml，溶解后室温保存。使用时稀释10倍，加入20%甲醇。可取10×溶液100ml, ddH2O 900ml，甲醇250ml。（重复利用再重新加入甲醇50ml） 六． 封闭液
1g脱脂奶粉于20mL 1X TBST混匀,4℃保存。保存时间不能太久，有味道就不能用了。
七． 抗体孵育用液
1X TBST缓冲液（使用液）：
24.2g Tris粉末，87.6g NaCl，10mL Tween20（AR)溶于800ml双蒸水中，用ddH2O定容至1000ml调节pH至7.4。室温保存。 10X TBST缓冲液（储存液）：
24.2g Tris粉末，87.6g NaCl，10mL Tween20（AR)溶于800ml双蒸水中，用ddH2O定容至1000ml调节pH至7.4。室温保存。 八． 丽春红染液（可回收利用） 九． 显影液
Western Lightning ECL Pro 十． STRIP膜再生
试剂 100ml 5ml 8ml 12ml 14ml 10% SDS 20ml 1ml 1.6ml 2.4ml 2.8ml 0.5M Tris HCl （pH6.8） 12.5ml 0.625ml 1ml 1.5ml 1.75ml ddH20 67.5ml 3.375ml 5.4ml 8.1ml 9.45ml β- mercaptoethanol 0.8ml 40ul 64ul 96ul 112ul
操作步骤：
（一） 蛋白样品制备
（1）待测蛋白细胞收集
1.准备冰盒，提前准备好需要的试剂和器材，EP管：标记好相关信息（细胞名称，蛋白提取，转染信息，时间）；离心管，滴管，含血清的培养液，胰蛋白酶，PBS。4℃离心机提前预冷；
2.弃掉皿内的无血清培养液（含血清的培养液，可直接收到相应的离心管），用1.0ml的PBS清洗，将PBS收到相应的离心管内，再用1.0ml的PBS清洗，收集PBS，每皿加1ml的胰蛋白酶进行消化，37℃，5min。
3.消化后将皿放在冰盒上，冰上操作。用培养液（可以用离心管内带血清的培养液）吹打细胞，收入离心管（可再冲洗一次，冲洗干净），将离心管配平后放1500r/5min离心。 4.取出离心管，吸掉上清（注意不要碰到蛋白固体），管底留少量液体，用手弹离心管底部，震荡离心管，加入1ml的PBS吹打几次后移入相应的EP管，在离心管再加入0.5ml的PBS清洗加入EP管。EP管配平后4℃，1500r/5min。
5.取出EP管，轻轻吸掉上清，留少许液体在底部，弹几下EP管进行震荡，加入1.5ml的PBS涡旋3-5次，配平后4℃，1500r/5min。
6.取出EP管，轻轻吸掉上清，留少许液体在底部，配平状态在4℃离心机进行离心，转速为最高转速14800转，达到此速度立刻停止，取出EP管，小心吸掉所有的液体。 7.将EP管放在-80℃冰箱内保存。
（2）细胞总蛋白的提取：
1.准备相应的试剂和器材，按照配方配置裂解液和 PMSF溶液，4℃离心机提前开机预冷，准备冰盒。
2.取出收集好的蛋白样品置于冰上。
3． 按照配方配置裂解工作液，（根据试剂盒实际要求）摇匀置于冰上。（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合），取40-50ul（细胞多用50ul）裂解工作液加入细胞EP管中，吹打均匀，涡旋几次，冰上裂解30min,（裂解期间每10min涡旋一次），裂解完成后再涡旋一次然后转移至4℃离心机14800r/20min（提前开离心机预冷）。取出离心后的EP管吸取上清，置于新的EP管中。
4. 将轻微离心后的上清可分装后放于－20℃保存。 （二） 蛋白含量的测定
1. 配置10ml 0.9%的生理盐水（90mg NaCl溶于10ml去离子水中），用于
配置相应的BSA梯度溶液。
2. 将标准样品和蛋白样品按下表稀释和加样
检测范围=(20-2000ug/ml) 瓶号 BSA含量 2mg/mlBSA 工作液 BSA终浓度(ug/ml) A 0ug - B 1ug 0.5ul C 2.5ug 1.25ul 200ul 100 D 5ug 2.5ul E 10ug 5ul F 20ug 10ul 15ul G 40ug 20ul 5ul H 50ug 25ul - 样品 1ul 24ul 0.9%saline 25ul 24.5ul 23.75ul 22.5ul 20ul 200ul 200ul 0 40 200ul 200ul 200ul 200ul 200ul 200ul 200 400 800 1600 2000 工作液最后加 ，加工作业速度要快，且在冰上操作。样品：工作液=1：8（25ul:200ul）
3. BCA A:BCA B=50:1,每孔需要200ul工作液。根据需要的数量配置工作液，所需工作液的总体积为：
(标准品的个数 + 待测蛋白质样品的个数)×( 实验重复次数)×(用于每个样品的工作液的体积) =所需的工作液
（当试剂 B 加入到试剂 A 中时，开始可观察到有浑浊产生，经搅拌后浑浊会迅速消失，得到绿色澄清工作液。工作液储存于密闭容器中，在室温下可稳定保存数天）
注：如果样品有限，则可取标准品和待测未知样品10ul（样品与工作液的比例为1:20）。然而，在这种情况下，定量分析的检测范围将被限制在125-2000g/mL。
A B C D E F G H I
标准蛋白样品 待测蛋白
4. 将微孔板密封，在 37℃恒温箱30转中孵育30分钟。（孵育时盖报纸避光）
5. 将微孔板冷却到室温。使用微孔板读数仪，测量样品在 562nm 或该波长附近的吸光值。打开酶标仪“Gen5 CHS 2.04”图标→新建记录→检测，吸收光→波长562→打开96孔板盖子放入机器开始检测，将结果复制到Excel中拷贝。
??该方法在波长 540-590nm 范围内均可成功得到结果。
由于微孔板酶标仪的光路长度比使用比色皿的分光光度计短，因此微孔板方案要求样品与工作液的比例更高，才能获得与试管标准方案相同的灵敏度。如果想要得到较高的562nm 处的吸光值，则需将孵育时间增加到2 小时。
延长孵育时间或升高温度将会增加样品在562nm 处的吸光值，也会降低试剂的最低检测下限和该方案的检测范围。
6. 将各个标准品和待测蛋白质样品在 562nm 处的吸光值根据公式计算出相应的蛋白浓度。
2016/3/9 全蛋白
ODOD OD0 －OD0 0.695 0.347 0.348 Test volume protein concentration (μg/μl) 6.90 Sample volume (μl) 40 protein (μg) Adding sample volume(μl/20μg蛋白) No. Sample name (μl) 1 Sample1 A549-Ctrl-2499.07 2.90 4h A549-NT siRNA-24h A549-NEK2 siRNA-24h A549-NEK2 siRNA-24h A549-Ctrl-48h A549-NT siRNA-48h A549-NEK2 siRNA-48h A549-NEK2 siRNA-48h Sample2 0.639 0.347 0.292 1 5.76 40 272.44 3.47 Sample3 0.709 0.347 0.362 1 7.18 40 289.56 2.78 Sample4 0.676 0.347 0.329 1 6.51 40 386.32 3.07 Sample5 0.591 0.347 0.244 1 4.79 50 411.31 4.17 Sample6 0.536 0.347 0.189 1 3.70 50 430.08 5.41 Sample7 0.574 0.347 0.227 1 4.45 50 354.13 4.49 Sample8 0.586 0.347 0.239 1 4.69 50 263.45 4.26
（三）蛋白变性
按下表进行配置：（上样缓冲液应新鲜配置）
NO. 样品用量（ul） ddH20 (ul) Loadingbuffer(ul) A549-Ctrl- 24h A549-NT siRNA- 24h A549-NEK2 siRNA-24h A549-NEK2 siRNA-24h A549-Ctrl- 48h A549-NT siRNA-48h A549-NEK2 siRNA-48h A549-NEK2 siRNA-48h 2.90 12.10 3 20 18 3.47 11.53 3 20 2.78 12.22 3 20 18 3.07 11.93 3 20 18 4.17 10.83 3 20 18 5.41 9.59 3 20 18 4.49 10.51 3 20 18 4.26 10.74 3 20 18 样品终含量（ug） 总体积（ul） 配置过程在冰上操作
漩涡震荡后70℃水浴10min，可以-20℃保存备用。
（四） SDS－PAGE电泳
（1） 清洗玻璃板：用水轻轻冲洗玻璃板，洗干净后用干净的纸或布擦干，然后将接触胶的一面用酒精擦洗，擦干后开始装配。玻璃板的下缘必须对齐。若不继续使用，需用乙醇擦拭后晾干再妥善收起来，梳子应用水洗干净，临用前用乙醇擦拭晾干。 （2） 灌胶与上样
1、 玻璃板对齐后放入夹中卡紧，然后垂直卡在架子上准备灌胶。装配好后，插入梳子，
在最上边的红线下侧一点点处（梳子插入的位置）用油笔做一条直线标记，分离胶加至此线。
2、 配置分离胶，在烧杯里放入旋子（旋子在放烧杯的一层），低速转动10-15min，然后加入50ul 10% APS和5ul TEMED后立即摇匀即可灌胶，烧杯口紧贴灌胶板，将分离胶灌入玻璃板夹层，待胶面升到画的界限，停止灌胶。然后胶上加一层双蒸水，平移均匀加入，加到满，压平分离胶，液封后的胶凝的更快，等待30-40min，待凝固后，形成明显的界限，倒出上层的双蒸水，并用纸吸干剩余的双蒸水。（操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。加双蒸水时要沿着玻璃板左右平移加，速度不能太快，否则胶会被冲变型。）
3、 在等待分离胶凝固的同时按前面方法配4％的浓缩胶,配好后在凝固好的前10-15min，烧杯里加入旋子慢速旋转10-15min，然后加入50ul 10% APS和5ul TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后选择合适的梳子插入浓缩胶中，待凝固。（灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。插梳子时要使梳子保持水平）实验提前5-8小时制作电泳胶/或过夜。（一块板可用2ml 1×TBST放在密封的袋中保存）
4.在分离胶凝固的同时配置电泳缓冲液并进行蛋白变性处理。
5、胶凝固后，取出PAGE胶板，用双蒸水冲洗干净，将胶水平放置，双手从两侧同时缓慢抽出梳子，用双蒸水轻轻冲洗胶孔，装入电泳槽板上，上推胶板以避免漏液，装入垂直槽固定架，将其放入电泳槽中，加入电泳缓冲液，用枪头插入胶孔轻轻吹打几次，赶出孔内液体。（小玻璃板面向内，大玻璃板面向外。若只跑一块胶，那槽另一边要垫一块塑料板且有字的一面面向外。）
6、 按照上样顺序将变性过的蛋白进行加样，在样品一侧加入10ul Marker,对应电极盖好盖子。
7、调整电压为100-120进行电泳，90min，随时观察，条带到底即可停止进行转膜。 （五）转膜
1.电泳过程配置转膜缓冲液
2将裁剪掉右上角的聚偏二氟乙烯（PVDF）膜泡入甲醇中（缓慢摇动）2min（硝酸纤维素（NC）膜不需要浸泡甲醛），用双蒸水冲洗干净，加入双蒸水摇动2min。在反应盆内倒入的转膜缓冲液，将海绵，滤纸和PVDF膜完全浸入缓冲液中，至少浸泡30min,需要浸泡的是两块滤纸，两块海绵，一块PVDF/NC膜。
3.将电泳完的凝胶玻璃板取出，用双蒸水冲洗干净，用塑料的铲子缓慢撬开小玻璃板，然后用浸泡过缓冲液的一块滤纸贴在胶上，反过来将玻璃板用长片撬下来，按照marker的标志切割目的蛋白所在区域的凝胶，将浓缩胶部分切除（大蛋白不需要切除），将转膜夹放
在转膜槽上，黑色在下，白色在上，在黑色板上铺上海绵，用移液枪吸取10mL的缓冲液，缓慢冲洗3次（有泡沫的部分不要吐出），然后用滚子朝一个方向滚，赶出气泡，重复三次，一共滚三次；然后将带有胶的滤纸铺上，滚三次，铺上膜，滚三次，铺上滤纸，滚三次，铺上海绵，滚3次，将白色盖板盖上，卡扣位置朝上，插入电泳槽，黑色对黑色，红色对红色，倒满缓冲液，对应电极盖上盖子。将电流调制40-42V进行转膜，转膜90min/或30V 4度overnight。转膜过程中配置1×TBST和封闭液。
4.转膜完成后取出PVD/NCF膜(膜上蛋白marker清晰，胶上无明显蛋白marker，表明转膜完全)，剪除无蛋白区域，在右上角剪去一角，已确认方向，将膜用双蒸水清洗三次，浸泡进丽春红染液中染色，置于摇床中速3min左右（丽春红染液回收），用双蒸水重复漂洗2-3次直至出现清，拍照记录晰条带，如条带清晰整齐则表明之前的步骤成功。再用TBST清洗一次（不能直接冲着膜加液）。 （六）封闭
1．转膜过程配置封闭液，在磁力搅拌器上一直搅拌溶解，溶解后4度保存备用。
2.将洗掉染液的PVDF膜取出放入盛有封闭液的方盒中，将膜完全浸润，盖好盖子，在摇床上中速摇动1h。 （七）抗体孵育
1.取出封闭后的膜加入1×TBST 5ml左右摇晃几下倒掉，倒入10ml（浸没）TBST，摇床中速15min，再清洗2次，每次5min。
2.将稀释后的一抗连同膜转移到密封塑料袋内（或者孵育盒内），在室温下转动1-2小时，转移至4℃冰箱中摇动过夜。
3.将过夜后的膜从一抗中取出（一抗回收）加入10ml（浸没）TBST，摇床中速15min，倒掉后再清洗2次，每次5min。
4.将稀释后的二抗倒入抗体孵育盒，将PVDF膜置于二抗中室温缓慢摇动30min-1h。（二抗回收）加入10ml（浸没）TBST，摇床中速5min，重复三次。 （清洗过的膜放在1×TBST，4℃保存）。（切带后，一个空需要大约1.5ml二抗）
（八）底物显影
1.将Western Lightning ECL Pro化学发光A液和B液按1:1的比例根据膜的大小选择合适用量在EP管中混合均匀（一整张膜需要1ml，即A,B液各0.5ml），将PVDF膜控干后铺于显影塑料盒内，将显影混合液均匀的涂在PVDF膜上，避光孵育5min左右，将膜夹在塑料膜内，将塑料膜置于显影仪器进行显影。打开Gene Sys软件→Blots→Chemi Blot(Series)
→BioRad blot(7×8.4cm)→ChemiFast(ECL Plus)→Marker 勾选→选择拍摄张数（根据实际情况选择）→勾选“…of previous image”→选择三张拍摄时间（30s，1min,3min根据实际情况选择）→调整曝光出来图像的效果→保存→关闭仪器。根据显影结果进行分析。 （九）STRIP膜再生 去除一抗二抗
1．将显影过的膜用双蒸水清洗几次，泡进strip缓冲液中，恒温箱内50度115转，孵育45min。
2．取出孵育后的膜用双蒸水清洗几次，用TBST在摇床上清洗3次，每次15min。 3.一抗过夜，二抗孵育，再显影。
前期准备：蛋白已经定量，各样本已经稀释到某固定浓度，已经和SDS loading buffer混合，已经分装好，保存与-20°。头天下午或晚上配胶，分离胶和浓缩胶一起配好，带上梳子，放入潮湿的自封袋内放入4°冰箱备用。
8:00 从冰箱里取出蛋白样品，用PCR仪95度加热5min。混合均匀并离心。
8:30 取出昨晚配好的胶，组合，加电泳液。在电泳液里拔梳子能稍微容易一些。用10ul的枪加样。
9:00 开始电泳。恒流30mA一般1个小时足够了。
9:30 开始准备转膜用的滤纸和PVDF膜，PVDF膜泡甲醇。一般8cm的宽是固定的，所以如果要裁胶的话可以先大概估计一下。
10:10 电泳结束（假设电泳用了70分钟），起开玻璃板，裁出胶上所要的条带，如果整块胶转就更方便了。把胶放在盛有转膜缓冲液的培养皿里。
11:00 转膜开始（这里裁纸和铺三明治还是比较费时间的，我一般要用30分钟到50min，所以这里要抓紧时间）。
12:00 转膜结束（这里按60min的半干转的时间来计算）。开始封闭1h。
13:00 封闭结束，开始孵育一抗（在这里你可以选择一抗孵育过夜，如果不过夜的那一天就能结束），如果不过夜的话我一般选择37° 1h然后在室温（23°左右）再1h。 15:00 一抗孵育结束。TBST洗涤3*10min或者5*6min。 15:30 开始孵育二抗。室温1h足够了。
16:30 二抗孵育结束。TBST洗涤3*10min或者5*6min，这里推荐采用5*6min。
17:00 ECL发光，压片10min，显影1min，定影10min，那么在18:00之前你就能看到结果了，呵呵，如果结果不好还有后招，用stripping（一抗二抗洗脱液）洗涤，我用的是碧云天的碱性一抗二抗洗脱液，按照说明书来一般20min就行，然后洗涤几次，重新封闭1h，然后一抗过夜，明日在继续战斗。这样的话18:30之前也能结束战斗了。