分子诊断学习题 Lucas Gu
的位置，因此更方便进行测序分析以确定突变。
PPT检测突变的缺点：①由于PCR扩增效率的影响，对于包含几千个核苷酸序列多个外显子的疾病基因，就需要分成几个1－2kb的片段分别扩增，分别进行PTT检测；②由于微小缺失/插入突变对蛋白产物分子大小影响太小，凝胶不能分辩，因而检测不出编码序列中小的插入或缺失或是错义突变；③引起RNA产量改变或使mRNA不稳定的突变可能被漏检。 4． 简述PFGE的基本原理
答：PFGE采用一种正交的交变脉冲电场，在进行琼脂糖凝胶电泳时，其方向、脉冲时间和电压大小可交替改变。在每次电场方向改变时，DNA分子就要有一定的时间改变形状和迁移方向，只有当DNA分子达到一定构型，沿新的泳动方面伸直后，才能向前迁移。DNA分子的转向时间与其大小关系极为密切，分子越大，分子构型转换所需时间就越长，转变迁移方向的时间也就越长。对于不同大小的DNA大分子，其改变泳动方向所需的时间不等，迁移速度的快慢也就不等，因此就可以按DNA分子量大小使其分离开来。根据欲分离的DNA分子大小适当调节电场方向的相交角度、电压及脉冲时间等参数，即可将各种分子量大小不同的分子分开。
5． 简述分子影像在分子诊断中的应用
答：分子影像可特异灵敏地探查疾病过程中相关分子的异常，能够提高临床诊治疾病的水平，在临床上有良好的应用前景。但其在分子诊断中的应用刚刚起步，主要集中于肿瘤、心脏和神经系统三大领域。
目前临床诊断中应用最多的是对肿瘤的临床检查，占临床检查总数的85%左右。有资料证实，PET可以使早期肿瘤的诊断率提高30％～40％。除了早期诊断，分子影像技术还可对肿瘤进行分期、分型，提示肿瘤的恶性程度和预后。分子影像在心血管系统疾病诊断则主要是关于心肌存活性对于心脏功能判断、临床治疗方案选择及心功能预后分析。对神经系统疾病的诊断多采用放射性核素成像系统对神经系统进行受体显像，可同时观察受体的分布和密度，为临床提供定量的检测数据。 6．简述常用的光学成像技术
答：目前的光学成像技术主要包括荧光（fluorescence）和生物发光（bioluminescence）两种技术。
荧光成像技术常用GFP、RFP及等近红外线（NIR）荧光素基因为报告基因。NIR荧光素是目前荧光成像研究的热点。将NIR荧光素与传送载体通过一段蛋白酶特异性肽段连接起来就形成了NIR探针。在原始状态由于存在荧光共振能量转移作用，NIR荧光素不发出荧光信号。当出现靶向蛋白水解酶将特异性肽底物降解时，荧光素与传送载体分离，荧光淬灭作用消失，NIR荧光素即释放出高达几百倍的荧光。通过这类探针能活体无创性检测多种蛋白酶的活性及疾病早期的病理现象，还能评价治疗效果。有点是组织穿透能力较强(可达数cm)，影像信噪比较高。
生物发光成像技术主要有两类报告基因：虫荧光素酶基因和Renilla虫荧光素酶基因，底物分别为虫荧光素和coelenterazine。通过分子克隆技术将荧光素酶基因插入靶基因，即可将所需研究的基因或细胞标记上荧光素酶，将标记好的细胞
注入小鼠体内后, 观测前通过腹腔或静脉注射导入荧光素酶的底物—荧光素，即可在几分钟内产生发光现象。其优点是无自发荧光，所得影像的信噪比高，因此检测的敏感性与特异性均较高，目前被广泛应用于小动物全身成像。
遗传性疾病的分子诊断
一、A型题：
1．α珠蛋白基因由α类基因或假基因组成，以下那一个不是假基因（ ）。 A．ψζ B．ψα1 C．ψα2 D．ζ E．以上均不是
2．镰状血红蛋白(HbS)氨基酸的变化为 A．谷氨酸→精氨酸 B．谷氨酸→赖氨酸 C．谷氨酸→缬氨酸 D．谷氨酸→组氨酸 E．谷氨酸→苯丙氨酸
3．甲型血友病的分子诊断分为基因倒位检测及非基因倒位的检测，检测基因倒位的首选方法为 A．PCR-RFLP
B．长距离PCR（LD-PCR） C．PCR-SSCP D．VNTR E．STR
4．囊性纤维化（CF）是由囊性纤维化穿膜传导调节因子（CFTR）基因突变所致，CFTR最常见的突变为： A．错义突变 B．移码突变
C．密码子突变（ΔF508） D．无义突变 E．剪切位点突变
5．亨廷顿致病基因-IT 15 基因外显子1 的起始密码子ATG下游17 个密码子处有一段多态性的三核甘酸重复序列，其为： A．CCG B．CAA C．CGA D．CAG E．CGG
6．脆性X 智力低下1 号基因( FMR-1) 基因5′端( )重复序列异常扩增。 A．CGG B．CAG C．CGA D．CGC E．CAA
分子诊断学习题 Lucas Gu
7．脆性X 智力低下1 号基因( FMR-1) 基因5′端重复序列异常扩增，其全突变重复范围（n）是 A．6～45 B．45～55 C．55～200 D．0～6 E．>200 8．CEPH
A．美国疾病控制中心 B．加拿大临床化学协会 C．人类多态性研究中心 D．美国病理学家协会 E．美国临床化学协会 8．
二、B型题：
A．IT 15 基因上CAG异常重复 B．DMD基因突变 C．PAH基因突变 D．CFTR基因突变
E．FMR-1基因内（CGG）异常重复及CpG岛异常甲基化 1．亨廷顿病 2．脆性x综合症 3．苯丙酮尿症 4．杜氏肌营养不良症 5．囊性纤维化
A．限制性内切酶MstⅡ切割法 B．长距离PCR法（LD-PCR） C．多重PCR
D．扩增产物变性聚丙烯酰胺凝胶电泳放射自显影 E．Southern印迹杂交法
6．亨廷顿病IT 15 基因CAG常用的分子诊断方法 7．目前脆性x综合症主要的分子诊断法 8．肌营养不良症分子诊断的常用方法 9．镰状细胞贫血分子诊断
10．甲型血友病基因倒位的分子检测法 三、X型题：
1．α地中海贫血在临床上包括以下类型： A．Hb Bart’s胎儿水肿综合征 B．轻型(标记型)α地中海贫血 C．遗传性胎儿Hb持续增多症 D．中间型地中海贫血 E．HbH病
F．静止型地中海贫血
2．杜氏肌营养不良症（DMD）分子异常的机制主要包括： A．基因缺失 B．点突变 C．插入 D．微小缺失
E．基因重复
3．PND和PGD的适应症
A．有可能孕育出严重遗传性疾病和先天性畸形胎儿的孕妇。 B．夫妇一方有某种遗传病或曾生出过某种遗传病患儿，或孕
妇有X伴性隐性遗传病家族史。
C．夫妇任何一方为染色体异常、染色体平衡移位和倒位携带
者。
D．早孕阶段曾服用过致畸药物或曾有病毒感染史等致畸情况。 E．羊水过多或过少。
F．原因不明的多次流产、死胎、死产的孕妇。 G．胎儿发育迟缓。 H．未触到正常的胎儿。 I．年龄超过35岁的孕妇等等。 4．遗传疾病分子诊断的策略 A．直接诊断策略 B．SSCP
C．基因多态性连锁分析 D．RFLP
E．基因突变的定量（dosage）诊断 5．β地中海贫血常用的分子诊断检测方法： A．PCR-RDB法 B．VNTR C．STR
D．PCR-RFLP法 E．基因芯片法
6．苯丙酮尿症常用的分子诊断检测方法： A．PCR-STR B．PCR-SSCP C．PCR-DGGE D．PCR-RFLP E．多重ASPCR 四、名词解释：
1．镰状血红蛋白(HbS) 2．植入前遗传学诊断（PGD） 3．苯丙酮尿症 五、问答题：
1．血红蛋白病及其分类。
2．试述点突变（基因背景清楚和未知）的主要检测方法。 3．试述限制性内切酶MstⅡ切割法诊断镰状细胞贫血的原理并图示。
4．试述近端重组、远端重组概念。
参考答案
一、A型题：
1.D 2.B 3.B 4.C 5.D 6.A 7.E 8.C 二、B型题：
1.A 2.E 3.C 4.B 5.D 6.D 7.E 8.C 9.A 10.B 三、X型题： 分子诊断学习题 Lucas Gu
1.ABDF 2.ABCDE 3.ABCDEFGHI 4.ACE 5.ADE 6.ABCDE 四、名词解释：
9. β珠蛋白基因中第6 位密码子的序列由原来的GAG改
变成GTG，结果β珠蛋白肽链的第6 位氨基酸残基由原来的谷氨酸改变成缬氨酸，改变后的血红蛋白称为镰状血红蛋白(HbS)。
10. 植入前遗传学诊断主要是指在显微操作下从体外受精发育
至6～8 个细胞期的胚胎中，活检1～2 个卵裂球细胞或直接获取受精前后的极体，通过聚合酶链式反应或荧光原位杂交，进行快速遗传学诊断，选择正常胚胎植入宫内，从而获得健康胎儿。
11. 由于肝内苯丙氨酸羟化酶（PAH）严重缺失所致的苯丙氨
酸代谢异常，为常染色体隐性遗传病。由于长期高苯丙氨酸血症导致脑组织的损伤和不可逆的智力发育障碍。 五、问答题：
3. 血红蛋白病(hemoglobinopathy)是由于血红蛋白在质和
量上的异常而发生的一类遗传性贫血病。它可分为两大类：一类是异常血红蛋白病，其Hb发生了结构上的异常，导致贫血病。例如镰刀状细胞贫血；另一类是地中海贫血，其构成Hb的蛋白部份—珠蛋白的合成降低或消失，而其Hb一般不发生结构上的变化，故亦称珠蛋白合成障碍性贫血。
4. 对基因背景清楚或部分清楚的点突变，可以采取直接检测
基因点突变的方法，如等位基因特异性寡核苷酸杂交(allele specific oligonucleotide，ASO)、PCR-ELISA、等位基因特异性扩增(allele specific amplification，ASA)、PCR-RFLP、基因芯片技术等进行诊断，例如β地中海贫血，可以使用ASO、PCR-RFLP 联合基因芯片技术进行诊断。
对于一些基因背景未知的点突变，可以采用单链构象
多
态
性
(single-strand
conformational
polymorphism，SSCP)、变性梯度凝胶电泳(denaturing graient gel electrophoresis，DEEG)、异源双链分析(heteroduplex analysis，HA)、DNA序列测定、蛋白截短测试（protein truncation test，PTT）等方法，如Hopkins大学医学院的研究人员设计了47 对PCR引物，分段扩增血友病A因子Ⅷ 基因片段，进行DGGE分析，发现多态性片段后再进行DNA序列分析，几乎查清了所有临床轻中度病人的点突变。
3．在FⅧ基因区域内，有一种A基因存在三个拷贝，其功能
不详，其中一个A基因位于FⅧ基因的第22 号内含子内(A1)，另外两个位于X染色体的末端(A2、A3)。A1基因可以与其上游的两个A基因拷贝中的一个发生同源重组，引起FⅧ基因的1-22 外显子片段倒位，这种倒位导致FⅧ功能完全丧失而发生严重的血友病(图15-5)。其中与A2发生的重组称为近端重组，约占倒位的15％；与A3发生的重组称为远端重组，约占倒位的85％。
4．在FⅧ基因区域内，有一种A基因存在三个拷贝，其功能不详，其中一个A基因位于FⅧ基因的第22 号内含子内(A1)，另外两个位于X染色体的末端(A2、A3)。A1基因可以与其上游的两个A基因拷贝中的一个发生同源重组，引起FⅧ基因的1-22 外显子片段倒位，这种倒位导致FⅧ功能完全丧失而发生严重的血友病(图15-5)。其中与A2发生的重组称为近端重组，约占倒位的15％；与A3发生的重组称为远端重组，约占倒位的85％。