性研究用样品最好选取处于最苛刻的灭菌条件的产品，如：可采用在热穿透试验中F0最大的位置上灭菌的产品进行稳定性考察，以确保灭菌产品的质量仍能符合要求。

2.1.2过度杀灭法的工艺研究

通常来说，与残存概率法相比，过度灭杀法所需的被灭菌品开始生产阶段和日常监控阶段生物负荷的信息较少，但是过度杀灭要求的热能比较大，其后果是被灭菌品降解的可能性增大。

过度杀灭法的目标是确保达到一定程度的无菌保证水平，而不管被灭菌产品初始菌的数量及其耐热性如何。过度杀灭法假设的生物负荷和耐热性都高于实际数，而大多数微生物的耐热性都比较低，很少发现自然生成的微生物的D121℃值大于0.5分钟。因此，过度杀灭的灭菌程序理论上能完全杀灭微生物，从而能提供很高的无菌保证值。由于该方法已经对生物负荷及耐热性作了最坏的假设，从技术角度看，对被灭菌品进行初始菌监控就没有多大必要了。

但这并不意味着生产过程中对污染可以完全不加控制。仅从控制热原的角度，也应当遵循工艺卫生规范，控制产品的微生物污染。如果实际生产中能够严格遵循GMP的要求，这一点是可以实现的。 2.1.3残存概率法的工艺研究

与过度杀灭法相比，残存概率法方法所需的信息量要大得多，包括被灭菌品生产开始阶段及常规生产阶段的信息、指示菌（对灭菌程序呈现强耐热性的试验菌）以及生物负荷的信息。只有积累了这类有价值的信息后，才能制定比过度杀灭法F0值低的热力灭菌程序，同时产品的无菌保证水平不会降低。使用热力较低灭菌程序更有利于药品的稳定性，使产品的有效期延长。正是因为这个原因，残存概率法更适合那些处方耐热性较差的最终灭菌产品。

通常说来，不耐热药品的灭菌可能不能使用过度杀灭法，需要设计一个灭菌程序能够恰当地杀灭生物负荷，同时不导致产品不可接受的降解。这种情况下，灭菌程序的确认就需研究产品的生物负荷和耐热性。根据以下公式可以比较清楚的说明这一点：

无菌保证值= F0 / D - lgN0

其中，无菌保证值是SAL的负对数，N0为灭菌开始时产品中的污染微生物总数，D为污染微生物的耐热参数。所以，菌工艺的无菌保证值与F0、N0、D密切

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相关。

2.1.3.1 灭菌前生物负荷的控制

采用残存概率法进行终端灭菌的产品，除了需要关注灭菌过程本身，还需要在生产过程中采用一些适当的手段来监测和控制药品灭菌前的生物负荷。具体的措施通常包括灭菌前微生物数量与耐热性的监测、药液过滤、工艺参数的控制等等。

灭菌前微生物污染水平的监测将在下面的章节详细阐述。产品过滤在终端灭菌的产品中仅仅作为辅助的控制手段，但是在工艺确定的过程中，也应该对滤膜的孔径、材质、滤器的使用周期进行必要的筛选。在工艺参数控制方面，由于微生物的特性，通常在药液放置期间也会逐渐繁殖，尤其一些营养型的注射液，如葡萄糖注射液、复方氨基酸注射液等，其环境更有利于微生物的生长和繁殖，因此应通过工艺筛选和验证来确定溶液配制至过滤前、以及过滤后至灭菌前能够放置的最长时限，并相应确定产品的批量、生产周期等关键工艺参数。 2.1.3.2 灭菌前微生物污染的监测

灭菌前微生物污染水平的监测应在正常生产过程中取样并覆盖整个生产过程，取样设计应选取生产过程中污染最大，最有代表性的样品，且要充分考虑到产品从灌封到灭菌前的放置时间。一般而言，如果灌装持续一段时间，可从每批产品灌装开始、中间及结束时分别取样。污染水平检查可以采用如下的方法：先用灭菌的5%吐温充分湿润0.45um的滤膜，然后定量过滤药液，将此滤膜移至营养琼脂平板上，在30~35℃下培养3~7天，计数。

分离获得的污染菌需要进行耐热性的检查。污染菌的耐热性检查可以采用以下的测定方法：先用灭菌的5%吐温充分润湿0.45um 的滤膜，然后过滤污染水平监测所取的药液样品，再将此膜移至装有无菌的待监测产品的试管中，在沸水浴上煮沸约30分钟，然后在30-35℃下在硫乙醇酸盐肉汤中培养，观察是否有耐热菌生长。

当耐热性检查发现药液存在耐热污染菌污染时，可采用定时煮沸法将它和已知的生物指示剂的耐热性加以比较，必要时，可再测试耐热污染菌的D值（D值的具体检测方法详见附件2），然后根据灭菌的F0值及污染菌的数量与耐热性对产品的无菌做出评价。当产品微生物污染水平超标准时，应对污染菌进行鉴别、调查污染菌的来源并采用相应的纠正措施。

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2.2湿热灭菌工艺的验证

湿热灭菌工艺的验证一般分为物理验证和生物学验证两部分，物理验证包括热分布、热穿透试验，生物学验证主要是微生物挑战试验。物理验证是证实灭菌效果的间接方式，而微生物挑战试验则直接反映灭菌的效果，两者不能相互替代。 2.2.1物理确认

2.2.1.1空载热分布试验

空载热分布的目的是主要是了解整个灭菌设备的运行情况，确认灭菌室内的温度均匀性，测定灭菌腔内不同位置的温差状况，确定可能存在的冷点。空载热分布试验通常采用足够数量的热电偶或热电阻作温度探头，进行编号后将它们固定在灭菌柜腔室的不同位置。温度探头的安放位置需要根据设备类型和不同位置下的灭菌风险评估而定，应包括可能的高温点、低温点，灭菌柜温度控制探头处、靠近温度记录探头处，其他的探头可以均匀地分布于灭菌柜腔室内，以使温度的检测具有较好的代表性。温度探头在试验前后至少需要两个温度点进行校正。温度探头安放结束后，即可以按照设定的灭菌程序进行灭菌。 2.2.1.2装载热分布试验

装载热分布试验的目的是了解设备在装载条件下内部的温度分布状况，包括高温点、低温点的位置，为后续的评估和验证打下基础。装载热分布一般在空载热分布的基础上进行。温度探头的个数和安放的位置一般同空载热分布试验，注意一定要在空载热分布试验确定的冷点安放温度探头。温度探头安放在待灭菌的容器的周围，注意不能介入待灭菌的容器。

装载热分布试验需要考虑最大、最小和生产过程中典型装载量情况，进行试验时，应尽可能使用待灭菌产品，如果采用类似物，应结合产品的热力学性质等进行适当的风险评估。待灭菌产品的装载方式和灭菌工艺的各项参数的设定应与正常生产时一致，应采用图表的方式说明产品的装载情况，并评估探头放置是否合理。如果待灭菌产品存在不同包装规格或浓度规格，应评估验证所采用的样品和装载方式是否能充分反映所有样品的实际装载情况。每一装载量的热分布试验需要至少进行三次。温度探头在试验前后同样均需要进行校正。 2.2.1.3 热穿透试验

热穿透试验是考察灭菌柜和灭菌程序对待灭菌产品适用性的一项试验。热穿透试验的目的是确认产品内部也能达到预定的灭菌温度。对于药物而言，灭菌程

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序既要赋予产品一定的F0值，以保障产品的SAL≤10－6 。同时灭菌程序又不应使产品受热过度而造成药物部分降解，以致同一灭菌批次的产品出现质量不均一。

热穿透试验所用的温度探头的个数和安放位置需要根据热分布试验的结果确定。一般可以采用足够数量的温度探头。应将热穿透温度探头置于液体容器中的冷点，即整个包装中最难灭菌的位置。如果有数据支持或有证据表明将探头放在产品包装之外也能够反映出产品的热穿透情况，风险能够充分得到控制，也可以考虑将探头放在容器之外。插有温度探头的产品的安放位置包括热分布试验确定的冷点和高温点、其他可能的高温点、灭菌柜温度探头附近、温度记录探头处。

热穿透试验的步骤及要求与装载的热分布试验基本相同，每一装载方式的热穿透试验也需要至少进行三次。通过热穿透试验可以确定在设定的灭菌程序下，灭菌柜内各个位置的待灭菌产品是否能够到达设定的温度。结合灭菌前微生物污染的检测，可以确定灭菌柜内各个位置的待灭菌产品是否能够获得设定的F0值。

对于F0值最大点位置的样品，由于其受热情况最为强烈，因此应评估该位置下产品的稳定性情况，以进一步确认灭菌对于产品的稳定性没有影响。 2.2.1.4热分布和热穿透试验数据的分析处理

在物理确认试验中，应确认关键和重要的操作参数并有相应的文件和记录。通常需要关注的主要参数包括

- 每个探头所测得温度的变化范围 - 不同探头之间测得的温度变化范围 - 探头测得的温度与设定温度之间的差值 - 探头测得超过设定温度的最短及最长时间 - F0 的下限及上限

- 灭菌阶段结束时的最低F0值 - 灭菌阶段的最低和最高压力 - 饱和蒸汽温度和压力之间的关系 - 灭菌阶段腔室的最低和最高温度

- 热穿透温度探头之间的最大温差或F0 的变化范围 - 热分布试验中温度探头间的最大温差 - 最长平衡时间

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