分子生物学讲义 下载本文

一复制子构成,因此与唯一起点约180°处就有一个单一终点。

复制子:以单一单位复制的任一段DNA都称为复制子。 起始点:复制子开始其复制的一段DNA序列。

终止点:复制子通常停止其复制的一段DNA序列。 2、半保留复制机制 1958年,Meselson和Stahl研究了经15N 标记的大肠杆菌,首次证明了DNA的半保留复制。

3、半不连续复制

验证试验:E.coli用3H-脱氧胸腺嘧啶(一个具放射活性的DNA前体)标记几秒钟,用碱性蔗糖梯度对新生DNA进行离心,根据分子大小,变性DNA的单链会分开,结果发现大量新合成的1000~2000nt(真核中是100~200nt)长的小片段。如果这些细胞进而在未标记的胸腺嘧啶中培养,这些冈崎片段很快便连成大分子的DNA。

4、RNA引导

对冈崎片段的仔细研究,与前导链的头几个一样,每一片段5’端的头几个核苷酸均是核糖核苷酸,因此DNA合成是由RNA引导的。这些引物在片段连接之前被去掉,产生间隙由DNA填补。用RNA引导DNA复制的原因可能是出于保证DNA复制的高忠实性。

二、DNA复制具体过程

双链DNA的复制是一个涉及酶活动的复杂的聚合反应过程,可分为起始、延伸和终止三个不同的阶段。

·起始阶段:涉及蛋白复合物对复制原点的识别, 在DNA合成开始前,双链DNA必需分离,并维持暂时的单链状态,然后在复制叉处开始子链的合成。

·延伸阶段:由另一蛋白复合物(复制体)负责, 随着复制体沿着DNA移动,母链解链和子链合成开始。

·终止阶段:在复制子的末端有特定的终止序列,复制体到达终止序列时便停止DNA合成,合成终止后,复制的染色体必需分离到子代细胞中。

1、DNA复制过程中所需要的一些酶 (1)DNA解旋酶(DNA Helicases)

(2)单链结合蛋白(DNA single-stranded binding proteins,SSB蛋白) (3)DNA拓扑异构酶(DNA Topoisomerase) (4)DNA 聚合酶(DNA polymerase)

大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的性质比较 5’→3’聚合酶活性 3’→5’外切酶活性 5’→3’外切酶活性 新生链合成 相对分子量(×103) 细胞内分子数 聚合酶Ⅰ + + + - 103 400 聚合酶Ⅱ + + - - 90 ? 聚合酶Ⅲ + + - + 900 10~20 生物学活性 已知的结构基因 1 polA 0.05 polB 15 polC (dnaE,N,Z,X,Q) 真核生物DNA聚合酶的特性比较

相对分子质量(×103) 在细胞内的分布 功能 相对活性 亚基数 DNA聚合酶α DNA聚合酶β DNA聚合酶γ 110~220 核内 DNA复制 约80% 多个 45 核内 DNA损伤修复 10%~15% 1个 60 核和线粒体内 ? 2%~15% 1个 (5)引发酶(Primase) (6)DNA连接酶(DNA Ligase ) 2、DNA复制的一般模式

(1)在DNA旋转酶、DNA螺旋酶以及单链结合蛋白的作用下DNA分子被解旋,准备下面的合成。

(2)游离的3'OH 为复制所必须,但当双链分开后,不存在这样的游离基团,这时合成的RNA引物提供游离的3'OH并开始复制。

(3)复制叉朝一个方向移动,但DNA复制的方向只能是5'→3'进,这通过冈崎片断来解决,形成后随链中不连续的短小片断,而前导链则为一连续的DNA片断。

(4)DNA聚合酶I的外切酶活性,切除RNA引物。

(5)DNA 聚合酶I发挥5'→3'聚合酶活性,补平由RNA引物留下的沟。 (6)DNA 连接酶灾补平最终残留的小缺口。 3、末端复制问题(The end-replication problem)

后随链合成中所需要的引物将被去除。在染色体末端,最后一个引物被去除后,这一段空隙不能合成。因此,后随链与模板相比,至少要少一个引物的长度。这就是所谓的“末端复制问题”。

细菌的DNA 是环状的,因此不存在末端复制问题。 在真核细胞中,染色体末端的端粒结构至少有两方面的功能:防止染色体间互相融合以及解决末端复制问题。

第六章 DNA损伤、修复及重组

一、诱变 (一)突变

1、定义:突变是DNA碱基序列水平上的永久性的、可遗传的改变,包括碱基的替换、插入和缺失。

2、突变产生的原因:

·DNA复制或减数分裂重组过程中的自发性错误 ·物理或化学试剂损伤DNA 3、点突变:单一碱基的改变。

·转换:嘌呤与嘌呤之间,嘧啶与嘧啶之间互换 A?G T ?C

·颠换:嘌呤与嘧啶之间发生互换 A ?T or C T ? A or G G ?T or C C ? A or G

4、点突变的表型效应:

(1)沉默突变:发生在DNA的非编码区、非调节区或密码子的第3个碱基位置,突变不会影响掺进蛋白质中的氨基酸。

(2)错义突变:改变了基因产物的1个氨基酸。

(3)无义突变:形成新的终止密码子的突变。结果会产生截短了的蛋白质产物。

5、插入突变/缺失突变:

涉及一个或多个碱基的增加或丢失,这会引起基因的移码突变。 (二)复制忠实性

·碱基配对的错误频率约为10-1-10-2

·在DNA复制酶的作用下碱基错误配对频率降到约10-5-10-6

·DNA聚合酶还会暂停催化作用,以其3’-5’外切核酸酶的活性切除错误接上的核苷酸,然后再继续正确的复制

·校正后的错配率仍约在10-10左右,即每复制1010个核苷酸大概会有一个碱基的错误

(三)诱变剂 1、物理诱变剂 ? 紫外线

是引起DNA损伤的最重要的方式。当DNA受到最易被其吸收波长(~260nm)的紫外线照射时,主要是使同一条DNA链上相邻的嘧啶以共价键连成二聚体,相邻的两个T、或两个C、或C与T间都可以环丁基环连成二聚体,其中最容易形成的是T-T二聚体。

人皮肤因受紫外线照射而形成二聚体的频率可达每小时5×104/细胞,但只局限在皮肤中,因为紫外线不能穿透皮肤。但微生物受紫外线照射后,就会影响其生存。紫外线照射还能引起DNA链断裂等损伤。 ? 电离辐射

电离辐射损伤DNA有直接和间接的效应,直接效应是DNA直接吸收射线能量而遭损伤,间接效应是指DNA周围其他分子(主要是水分子)吸收射线能量产生具有很高反应活性的自由基进而损伤DNA。

①碱基变化 主要是由OH-自由基引起,包括DNA链上的碱基氧化修饰、过氧化物的形成、碱基环的破坏和脱落等。一般嘧啶比嘌呤更敏感。

②脱氧核糖变化 脱氧核糖上的每个碳原子和羟基上的氢都能与OH-反应,导致脱氧核糖分解,最后会引起DNA链断裂。

③DNA链断裂 这是电离辐射引起的严重损伤事件,断链数随照射剂量而增加。

④交联 包括DNA链交联和DNA-蛋白质交联。同一条DNA链上或两条DNA链上的碱基间可以共价键结合,DNA与蛋白质之间也会以共价键相连 2、化学诱变剂

? 碱基类似物、修饰剂

碱基类似物:是改变碱基配对特性的正常碱基衍生物。 亚硝酸:C→U,从而U和A 配对,引起GC→AT转换 ? 烷化剂

烷化剂:如甲烷磺酸甲酯(MMS)、乙基亚硝基尿(ENU)等,可使DNA发生各种类型的损伤。

①碱基烷基化 ②碱基脱落 ③断链 ④交联

(四)诱变的类型

1、直接诱变:起因于DNA中存在稳定的、具有改变了配对特性的未修复的碱基。

正是DNA的复制使得这种损伤(非永久性的)固定下来成为突变(永久性的,可遗传的)。

2、间接诱变

化学和物理诱变剂导致损伤的绝大部分,在与复制叉相遇之前会成为一种或多种DNA修复机制作用的目标,从而恢复到无差错状态的DNA原初结构。

如果损伤发生在移动着的复制叉之前,这会导致在子链上产生一个致命的缺口,此时细胞不得不采取“转移损伤DNA合成”。

转移损伤DNA合成有可能正确,从而插入正确的碱基,但被破坏的碱基往往失去了特殊的碱基配对性,所以一些损伤DNA聚合酶只是为了保证染色体的完整性在损伤对应的位点上插入错误的碱基,这就叫间接诱变。

二、DNA损伤

1、定义:DNA物理或化学结构的改变。

·碱基杂环上的一些N和C原子以及环外功能团具有相当的化学活性,许多外源物质(如化学试剂、射线等)能引起这些位点的改变。

·如果损伤允许在DNA中保留下来,这一突变就会通过直接诱变或间接诱变而被固定下来。

·DNA损伤可以是致突变和(或)致死。 2、损伤类型:

(1)自发性DNA损伤:DNA内在的化学活性以及细胞中存在的正常活性化分子导致的DNA损伤。

·转氨作用(C→U) ·脱嘌呤作用 ·脱嘧啶作用 (2)氧化性损伤

在所有需氧细胞中由于超氧化物、氢过氧化物和羟基自由基等活性氧(ROS)的存在,在正常情况下会发生氧化损伤