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蛋白质及酶工程复习题

简答题： 1、 分子报告

报告分子是一类易于检测的蛋白质，将其与目的基因融合，通过它的表达产物来标定目的基因的表达调控，分子报告即是这样的一种标定检测技术。该技术具有高灵敏度、检测方便且适合大规模检测的优点。具有以下特点： 1、报告分子应不存在于宿主中或易于和内源性基因相区别；

2、应该有一个简单、快速、灵敏及经济的分析方法来检测报告分子；

3、报告分子的分析结果应该具有很宽的线性范围，以便于分析启动子活性的幅度变化；

4、报告基因的表达必须不改变受体细胞或生物的生理活动。

2、 核酶:

核酶(ribosome)指的是具有催化活性的RNA, 即化学本质是核糖核酸(RNA), 却具有酶的催化功能。核酶的作用底物可以是不同的分子, 有些作用底物就是同一RNA分子中的某些部位。核酶的功能很多,有的能够切割RNA, 有的能够切割DNA, 有些还具有RNA 连接酶、磷酸酶等活性。与蛋白质酶相比，核酶的催化效率较低，是一种较为原始的催化酶。此外，一些单链DNA同样具有生物酶活性，目前只能人工合成。

RNA核酶主要有以下几种：Ⅰ型内含子、Ⅱ型内含子、RNaseP的RNA亚基、发夹状核酶、锤头状核酶、肝炎δ病毒核酶、VS核酶。

3、噬菌体展示技术 原理:

噬菌体展示技术是将多肽或蛋白质的编码基因或目的基因片段克隆入噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置(在阅读框正确且不影响其他外壳蛋白正常功能的情况下)，使外源基因产物与衣壳蛋白融合表达，外源蛋白随噬菌体的重新组装而展示到噬菌体表面的生物技术。 主要步骤：

将待筛选基因插入噬菌体信号肽序列与主要衣壳蛋白基因(基因Ⅷ或基因Ⅲ)之间,构成融合蛋白噬菌体库。经过吸附→洗涤→洗脱→繁殖的一个富集过程称淘洗。即先将目标蛋白固相化，如结合在塑料板的小孔表面上，加入噬菌体库并与目标蛋白或肽反应，经过清洗，将非特异结合的噬菌体洗掉，俘获有亲和力的，洗脱的可以再感染大肠杆菌而增殖。一轮淘洗使噬菌体富集103倍经几轮淘洗获得与目标蛋白相互作用的肽。 原则：

一、形成的融合蛋白表达在噬菌体表面，不影响也不干扰噬菌体生活周期，为保持外源蛋白天然构象，能被相应抗体或受体识别； 二、利用固定相支持物靶分子，采用适当的筛选方法，洗去非特异结合的噬菌体，筛选出目的噬菌体； 三、外源多肽或蛋白表达在噬菌体表面，其编码基因作为病毒基因组一部分可通过分泌型噬菌体的单链DAN测序推导出来。 应用：1、与蛋白质工程

将编码随机多肽的寡核苷酸克隆岛噬菌体展示载体上，构成高容量的多肽文库，

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可用于特异性功能多肽的筛选。同样，利用噬菌体展示的cDAN文库，可筛选出特定的蛋白质或基因。2、与抗体工程??

4、分子印迹

将各种生物大分子从凝胶转移到一种固定基质上的过程称为印迹技术（blotting）。 原理：

当模板分子（印迹分子）与聚合物单体接触时会形成多重作用点，通过聚合过程这种作用就会被记忆下来，当模板分子除去后，聚合物中就形成了与模板分子空间构型相匹配的具有多重作用点的空穴，这样的空穴将对模板分子及其类似物具有选择识别特性。 步骤:

1.在一定溶剂（也称致孔剂）中，模板分子与功能单体依靠官能团之间的共价或非共价作用形成主客体配合物； 2.加入交联剂，通过引发剂引发进行光或热聚合，使主客体配合物与交联剂通过自由基共聚合在模板分子周围形成高联的刚性聚合物； 3.将聚合物中的印迹分子洗脱或解离出来。 分类

1.共价键法（预组装方式）聚合前印迹分子与功能单体反应形成硼酸酷、西夫碱、亚胺、缩醛等衍生物，通过交联剂聚合产生高分子聚合物，用水解等方法除去印迹分子即得到共价结合型分子印迹聚合物 。 2.非共价键法（自组装方式）非共价键法是制备分子印迹聚合物最有效且最常用的方法。这些非共价键包括静电引力（离子交换）、氢键、金属鳌合、电荷转移、疏水作用以及范德华力等。其中最重要的类型是离子作用，其次是氢键作用。 聚合方法

1、包埋法 将蛋白质分子、功能载体、交联剂和诱发剂通过光引发或热引发制成块状聚合物，经粉碎、过筛得到细小颗粒，该法易于控制；而且对蛋白有良好的识别能力。

2、表面印迹法 将蛋白转铁蛋白在溶液中与硼酸酯硅烷发生作用，然后在多孔硅胶颗粒上进行聚合，高效液相色谱（HPLC）检测显示，该聚合物对转铁蛋白显示了特异性吸附，但较为微弱。该法识别位点处于颗粒表面，通常在微球表面进行键合作用，颗粒均匀，易洗脱并可提高吸附性能再色谱操作或制备制备生物芯片方面有良好应用前景。

3、抗原决定基法 将印迹大分子蛋白简化为印迹小分子，降低了实验难度抗原决定基法的关键在于对蛋白质三级结构的掌握和特异性短肽片段的选取。 应用潜力：

1、分离领域 提供了简单、直接制备对蛋白质分子具识别能力的材料的方法。 2、模拟抗体 模拟抗体可代替天然抗体用于免疫分析中，可免于用制备抗体的动物和相应的免疫技术。 3、生物感应器 以酶或抗体做为其特异识别元件，除具传统生物感应器优点还有制作成本低、耐受性高、寿命长等，可大规模应用。

5、 亲和标记

亲和标记是一类位点专一性的化学修饰，试剂（抑制剂）可以专一性地标记

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于酶的活性部位上，使酶不可逆地失活，因此又称为专一性的不可逆抑制作用。属于这一方面的抑制剂可分为两类：一类是KS型的不可逆抑制剂，另一类是Kcat型的不可逆抑制剂。前者是根据底物的结构设计的，它具有和底物结构相似的结合基团，同时还具有能和活性部位氨基酸残基的侧链基团反应的活性基团。 后者则是根据酶催化过程设计的。设计或应用此类抑制剂，要求对酶的作用机制先有一定了解。这类抑制剂具有和底物类似的结构，具有被酶结合和催化的性质。此外，还有一个潜伏反应潜伏基团，在酶对它进行催化反应时，这个潜伏的反应基团被酶催化而活化，对活性为起不可逆抑制剂作用。这类抑制剂的转移行很高，常被人们称作“自杀性底物”。（例如，对以芳香族氨基酸为特异的基质的胰凝乳蛋白酶，用基质类似物的TPCK（L-1-甲苯磺酰胺-2-苯乙基氯甲基酮）与之反应，则TPCK在苯丙氨酸之侧链部分与胰凝乳蛋白酶进行特异的结合，在氯化甲酮部分反应，只是在活性部分存在的组氨酸残基有选择地烷基化。）光亲和标记是亲和标记中极其重要的一类。光亲和标记试剂在结构上出来有一般亲和时间的特定，还具有一个光反应基团。这类试剂反应一般分为两步进行：第一步，试剂先与蛋白质的活性部位在暗条件下发生特异性结合。第二步，光照，试剂被光激活后，产生一个高度活泼的功能基团，与活性部位的侧链基团发生反应。

6、 什么是抗体酶？简述获得抗体酶的过程？

抗体酶是一种具有催化功能的抗体分子，在其可变区赋予了酶的属性。 获得抗体酶有诱导法、引入法、拷贝法三种，主要过程分别如下： 诱导法

(1)设计好适合的半抗原；

(2)将半抗原通过间隔链与载体蛋白（例如牛血清白蛋白等）偶联制成抗原； (3)采用标准的单克隆抗体来制备、分离、筛选抗体酶。 引入法

采用选择性化学修饰方法，或者采用白质工程和基因工程技术将催化基团或辅助因子引入到抗体的抗原结合部位。 拷贝法

(1)用酶作为抗原免疫动物得到抗酶的抗体；

(2)再将此抗体免疫动物并进行单克隆化，获得单克隆的抗抗体； (3)对抗抗体进行筛选，获得具有原来酶活性的抗体酶。

7、 蛋白质芯片

蛋白质芯片是一种高通量的蛋白功能分析技术，可用于蛋白质表达谱分析，研究蛋白质与蛋白质的相互作用，甚至DNA－蛋白质、RNA－蛋白质的相互作用，筛选药物作用的蛋白靶点等。原理：它是将大量预先设计的蛋白质分子或检测探针固定在芯片上组成密集的阵列，利用抗原与抗体、受体与配体、蛋白与其他分子的相互作用进行检测。

根据用途的不同，蛋白质芯片可分为：1、蛋白功能芯片：将天然蛋白、酶或酶底物固定在载体上高通量分析，可用来进行蛋白-蛋白、蛋白-多肽、蛋白-小分子、蛋白质-DNA反应的研究。2、蛋白检测芯片：将具有高度亲和特异性的蛋白质或多肽固定在载体上，制备检测芯片用以识别复杂生物样品中的抗原、目标多肽和蛋白。

优点：1、快速、定量分析大量蛋白质；2、使用简单，结果正确率较多，只

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需少量血样标本即可进行分析和检测；3、采用光敏染料标记，灵敏度高，准确性好；4、所需试剂好，可直接应用血清样本，便于诊断，实用性强。

8、 蛋白质打靶技术

基因打靶技术是一种定向改变生物活体遗传信息的实验手段。它采用了一种被称为免疫外源凝集素的新工具，这是一种通过DNA重组技术而获得的IgG的Fc片段和目标受体胞外域的融合蛋白。通过对生物活体遗传信息的定向修饰（包括基因灭活、点突变引入、缺失突变、外源基因定位引入、染色体组大片段删除等），并使修饰后的遗传信息在生物活体内遗传，表达突变的性状，从而研究基因功能等生命科学的重大问题，以及提供相关的疾病治疗、新药筛选评价模型等。 影响基因打靶技术的因素：1 同源片段来源及长度的影响 2 调控元件的影响 3 外源DNA导入方法的影响4 靶基因位点的影响

优点：1、与基因打靶技术仅限于在鼠体应用不同，蛋白打靶原则上可用于任何物种。2、与单克隆技术抗体相比，其在改变靶目标功能方面是高效的；3、免疫外源凝集素是高度稳定的蛋白，不像反义核苷酸易被降解，经典的药理学研究缺少蛋白打靶高度稳定的蛋白。

缺陷：不能与细胞内的蛋白相作用，应用仅限于抗体。

三、固定化后酶性质的变化

1. 固定化对酶活性的影响：酶活性下降，反应速度下降 原因：酶结构的变化、空间位阻 2. 固定化对酶稳定性的影响

a) 操作稳定性提高

b) 贮存稳定性比游离酶大多数提高。

c) 对热稳定性，大多数升高，有些反而降低。 d) 对分解酶的稳定性提高。 e) 对变性剂的耐受力升高 3. pH的变化

（1）改变酶的空间构象

（2）影响酶的催化基团的解离 （3）影响酶的结合基团的解离

（4）改变底物的解离状态，酶与底物不能结合或结合后不能生成产物。 4． 最适温度变化

一般与游离酶差不多，但有些会有较明显的变化。 5． 底物特异性变化

作用于低分子底物的酶 特异性没有明显变化

既可作用于低分子底物又可作用于大分子低物的酶 特异性往往会变化。

10、酶定向进化

1.酶分子定向进化，简称酶定向进化，是模拟自然进化过程（随机突变和自然选择），在体外进行酶基因的人工随机突变，建立突变基因文库，在人工控制条件的特殊环境下，定向选择得到具有优良催化特征的酶的突变体的技术过程

2.酶定向进化的一般过程：1）.随机突变：一般运用PCR技术、DNA重排技