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8、 什么叫做DNA重排技术?其主要过程包括哪些步骤?

DNA重排技术:根据DNA片段在基因组中位置的变化,即从一个位置变换到另一个位置,从而改变基因活性的一种调节方式。DNA改造(DNA shuffling)技术是目前分子定向进化技术中最成功,也是应用最广泛的随机突变方法,其原理(步骤)如下:

1) 单个基因或一组相关基因经酶切产生一系列随机大小的DNA片段。

2) 无引物PCR,具有互补3’末端的片段互为引物,各为模版,通过不断的PCR

循环在不同模版上随机互补结合并进一步延伸。

3) 最后利用基因两端序列为引物合成全长的重排产物。这些重排产物的集合被

称作突变文库。

4) 对突变文库进行筛选,选择改良的突变体进行下一轮shuffling循环,重复

多次重排和筛选,知道最终获得性状比较理想的突变体。

5) DNA改组成功取决于三个因素:相关基因组中基因的相似程度、酶切产生的

DNA片段大小和退火温度。此外,如果将突变频率控制在适度范围内,能有效地在目的基因中引入点突变,使得DNA改组技术有更广阔的应用空间。DNA shuffling不仅可以在单个基因中引入突变,它也能对基因家族进行改造。该方法可以跨过物种界限,在不同的物种来源的DNA基因之间进行重组。

9、简述蛋白质分子设计的原理、程序。 原理: (网上找的)

1.内核假设。假设蛋白质独特的折叠形式主要由蛋白质内核中的残基相互作用决定。(所谓内核指蛋白质在进化过程中的保守区域,由氢键连接的二级结构单元组成。)

2.所有蛋白质内部都是密堆积且没有重叠。

3.所有内部的氢键都是最大满足的(主链和侧链)。

4.疏水和亲水基团需要合理地分布在溶剂的可及与不可及表面。分布代表了疏水效应的主要驱动力。要在原子水平上区分疏水和亲水部分;表面安排少许疏水基团、内部安排少许亲水基团。

5.金属蛋白质中配位残基的替换要满足金属配位几何。

6.对于金属蛋白,围绕金属中心的第二壳层的相互作用是最重要的。金属的第二壳层通常涉及蛋白主链的相互作用,有时也参与同侧链或水分子的相互作用。这些相互作用符合蛋白质折叠的热力学要求;氢键固定在空间的配位位置。

7.最优的氨基酸侧链几何排列。蛋白质侧链构象决定于立体势垒和氨基酸的位置。

8.结构及功能的专一性。 程序:

1、收集相关蛋白质的结构信息。收集待研究蛋白质的一级结构、立体结构、

功能结构域及与之相关的同源蛋白质等相关数据。为蛋白质分子设计提供依据和蓝本。

2、建立所研究蛋白的结构模型。

3、结构模型的生物信息分析。确定其三维结构的特点,功能活性区域以及

分布、结构中存在的二硫键数目和位置等,为选择设计目标提供依据。 4、选择设计目标。确定所要建造的三级结构,找出对所要求的性质有重要

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影响的位点或区域。

5、序列设计。选择的序列应尽可能不同于天然结构的序列,且要考虑氨基

酸结构形成特定二级结构的倾向性。 6、预测结果。预测多肽的二级结构和三级结构,初步检验设计的正确程度。 7、获得新蛋白。

8、新蛋白的检验。三方面检测:①是否存在蛋白质多聚体;②二级结构与

预期是否吻合;③是否有三级结构。 9、完成新蛋白的设计。

10、常见的融合蛋白标签和报告分子是什么? 书上的有的融合蛋白标签有poly-Arg、 poly-His、FLAG、Strep-tagⅡ、c-myc、S-Tag、HAT、3×FLAG、calmodulin-binding peptide、SBP、chitin-binding domain、cellulose-binding domain、glutathione S-transferase、Maltose-binding protein。

报告分子:氯霉素乙酰基转移酶(CAT)、β半乳糖苷酶、荧光素酶、分泌型碱性磷酸酶(SEAP)、荧光蛋白家族

11、如何在大肠杆菌中实现外源蛋白的高效表达? 1) 调整外源基因的A+T,放置提前终止的发生、可以用密码子的简并性来调整。 2) 采用非连续性多核苷酸定点突变方法对于cDNA中E.coli稀有密码子进行同

义突变来提高翻译速度和质量、防止突变影响蛋白质的结构与功能

3) 利用密码子简并性、采用大肠杆菌常用密码子、减少G、C含量、调整SD序

列与起始密码子的距离、预测TIR二级结构的形成、保证SD序列与ATG之间成单链状

4) 对于3-UTR的处理方式同上只是不必减少GC含量 5) 选择适合于外源基因的载体 6) 选择适合于重组载体的宿主菌

7) 采用化学诱导性启动子、控制细菌的生长速率、防止质粒拷贝数下降

8) 改造是宿主菌的蛋白水解酶缺失或者在培养液中加入其他外源蛋白来消耗

蛋白水解酶、或者调节Ph/使之不利于水解酶发挥作用、或者控制温度使其不利于蛋白水解酶的适宜温度范围 9) 选择合适的培养基、pH值温度等 10) 减少抑制乙酸等副产物的产生及作用 12、简述蛋白质的质谱分析原理与方法? 蛋白质质谱分析原理:

通过电离源将蛋白质分子转化为气相离子,然后利用质谱分析仪的电场,磁场将具有特定质量和电荷比值(M/Z值)的蛋白质离子分离开来,经过离子检测器收集分离的离子,确定离子的M/Z值,分析鉴定未知的蛋白质。 蛋白质质谱分析方法:

第一种称为蛋白图谱,它是使用特异性的酶解或化学水解的方法将蛋白质切成小的片段,然后用质谱检测各产物肽的分子质量,将所得肽谱数据输入数据库,搜索与之对应的一直蛋白,从而获取待测蛋白序列;

第二种方法是利用待测分子在电离及飞行过程中产生的亚稳离子,通过分析相邻同组类型峰的质量差,识别相应的氨基酸残基,其中亚稳离子碎裂既包括“自

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身”碎裂,又有外界作用诱导的碎裂;

第三种方法称为梯状测序,是用化学探针或酶解使蛋白或肽从N端或C端逐一降解下氨基酸残基,形成相互间差一个氨基酸残基的系列肽,再经过质谱检测,由相邻峰的质量差可知相应氨基酸残基。

13、电泳?有哪些主要的电泳方法用于蛋白质分离纯化和鉴定?

答:电泳:蛋白质是两性电解质,在一定的PH条件下,蛋白质带有电荷,不同的蛋白质所带的电荷的种类和数目不同,因此其在电场中移动的速度不同,从而把蛋白质分开,这种实验技术即为电泳。

主要方法: 1. 聚丙烯酰胺凝胶电泳2.等电聚焦电泳。3.双向电泳 具体原理与过程在书上P219——P223页。 14、蛋白质芯片技术特点及应用。

答:蛋白质芯片的概念:也叫蛋白质微阵列,是将大量蛋白质有规则地固定到某种介质载体上,利用蛋白质与蛋白质,酶与底物,蛋白质与其他小分子之间的相互作用检测分析蛋白质的一种芯片。(这个貌似题目没有要求,我觉得打上比较好)

蛋白质芯片的技术特点:它的主要优点体现在:1.快速,定量,同时分析大量蛋白质。2.使用简单,结果正确率较高,只需少量血样标本即可进行分析和检测。3.采用光敏染料标记,灵敏度高,准确性好。3、所需试剂少,可直接应用血清样本,便于诊断,实用行强。其不足在于稳定性及操作复杂,花费大,费时。(还有与传统分析与酵母双杂交系统的比较,在书本上P234下方)

蛋白质芯片技术的应用:1、基础研究:蛋白质-DNA相互作用研究;蛋白质-mRNA相互作用研究。

2、临床:蛋白质芯片技术在临床方面有着广泛的应用,尤其是在疾病的诊断和疗效判定,即生物学标志物的检测上。例如蛋白质芯片应用与自身免疫疾病的诊断。(具体例子请看P235)

3、新药研制:研制一种新药往往要对上千种化合物进行筛选,蛋白质芯片高通量,并行性的特点,大大地加快了化合物的筛选速度。通过蛋白质芯片观察由于暴露在药物作用之下而诱导的基因表达谱,从而能在药物开发的早期阶段进行各种正确的毒理学检测。

此外,蛋白质芯片技术还对中药现代化有巨大作用,将中药药性,功效与特定疾病的基因表达调控相关联,在分子水平上诠释传统的中药理论和作用机制,将对我国中药资源的发展影响深远。

蛋白质芯片提供了再蛋白质水平研究基因组中基因的功能,如酶活性,蛋白质-蛋白质间的相互作用,蛋白质-核酸间的相互作用,蛋白质-小分子药物间的相互作用。(具体例子P235下方) 4.环境监测及食品检验:用来检测环境或食品中的微量的有毒化学物质或病原菌(如大肠杆菌)。