1优点：不存在基因的非特异性激活或抑制；可严格调控基因表达；真核蛋白○

在表达时方便、高速、有效、易得

2缺点： 缺乏翻译后加工机制，不能折叠和糖基化； ○

融合蛋白易生成包涵体，复性后才有活性； 很难表达大量的可溶性蛋白

1化学合成法○2.基因组DNA文库○3.cDNA文库 （逆转录法）○4.聚合15. 目的基因制备方法：○

酶链式反应（PCR）

16. 分子杂交（碱基互补配对）：基因文库、CDNA文库 17. ＰＣＲ

（１） 定义：是用一对寡聚ＤＮＡ作为引物，通过加温变性（３０ｓ） →退火（３０

ｓ）→延伸（１ｍｉｎ）的多次循环，使目的基因得到特异性扩增

1DNA半保留复制的机理○2体外DNA分子于不同温度下可变性和复性的（２） 原理：○

性质

（３） 物料：4种dNTP、引物、模板DNA、Taq DNA聚合酶、Mg2+ （４） 过程：高温变性、低温退火（复性）及适温延伸

① 模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右30s后，使模板DNA双

链解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备

②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降

至40～60（55）℃左右30s，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合（退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基因序列的长度）

③引物的延伸：在Taq酶（在72℃左右１ｍｉｎ）的作用下，以dNTP为原

料，从引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补的DNA链。 Tm（解链温度）=4（G+C）+2（A+T） 复性温度=Tm值-（5-10℃） 1kb的DNA片段延伸时间1min

（５） 特点：特异性强、灵敏度高、简便、快捷、对标本的纯度要求低 18. 三个基本原件：载体、宿主细胞、目的基因

19. 多克隆位点：是包含多个限制性酶切位点的一段很短的DNA序列，是外源基因插入的

位置

20. DNA复制起点：发生复制的单个DNA单元称为复制子，每个复制子在每次细胞分裂期

只发动一次复制事件，复制子有控制启动复制的元件，称为复制起点

21. 核糖体结合位点（ＲＢＳ）：mRNA的起始AUG上游约8~13核苷酸处。存在一段由

4~9个核苷酸组成的共有序列（SD序列）-AGGAGG-，可被16SrRNA通过碱基互补精确识别。这段序列被称为核糖体结合位点。

1SD顺序与16srRNA3’末端互补程度 UAAGGAGG的SD序列比AAGGA的○

SD序列能使蛋白质的产量提高3——6倍

2AUG-SD间的距离 5-13bp ○

22. 核酸凝胶电泳：核酸凝胶电泳是分子克隆核心技术之一，用于分离、鉴定和纯化DNA

或RNA片段

（１） 主要检测：分子量、ＤＮＡ浓度

（２） 原理：ＤＮＡ分子带负电，向正极移动；分子量小的跑的快，分子量大的跑的慢 （３） 琼脂糖凝胶电泳

1琼脂糖种类： 常见的有两种：标准琼脂糖和低熔点琼脂糖 ○

2凝胶载样缓冲液：临上样到凝胶加样孔之前与待电泳的样品相混合的一种缓冲液 ○

主要成分：溴酚蓝/二甲苯青FF 40％蔗糖

3染色与摄影：主要有溴化乙锭（EB）染色法和 SYBR Gold染色法 ○

4DNA迁移率的影响因素：ＤＮＡ分子的大小（成反比） ○、琼脂糖浓度、DNA的构

像、凝胶和电泳缓冲液中的溴化乙锭、所用电压、琼脂糖种类、电泳缓冲液

23. 目的基因的重组：

（１） 本质：DNA片段之间的体外连接 （２） 载体的选择：

a) 质粒：可用于细菌细胞内独立复制，有的亦可用于动、植物细胞。 b) 噬菌体：经构建后，常用于细菌细胞。 c) 病毒：常用作动物细胞基因工程的载体

（３） DNA分子的体外连接：粘性末端连接、平端连接、人工接头法、同聚物结尾法 （４） 将重组ＤＮＡ导入宿主细胞：重组体DNA分子只有导入合适的受体细胞，才

能进行大量的复制，扩增和表达（感受态细胞的制备、连接产物的转化） a) 转化：制备感受态细胞→冷的氯化钙处理，细胞处于最适摄取和容忍外来

ＤＮＡ的生理状态

b) 感受态细胞：细胞处于最适摄取和容忍外来ＤＮＡ的生理状态

1大肠杆菌结合交配期染色体标记的单向转移○2可整合到宿主染色体中 24. F质粒：○