质粒DNA的提取和酶切

实验原理

质粒是一种双链的共价闭合DNA分子，它是染色体外能够稳定遗传的因子。质粒一般来自细菌，分离和纯化质粒DNA的方法很多，但都包括以下几个步骤，细菌的培养和质粒的扩增、菌体裂解、质粒DNA的纯化。在细胞内，质粒以超螺旋的形式存在，在一些条件下，一条链和多处断裂则另一链能自由的旋转形成开环DNA分子。加热或者碱处理虽然可以解开双链中的氢键，但随着冷却或PH恢复到中性它们又能很好的复性到原来的共价闭合环，线性DNA分子却仍处于变性状态。

限制性内切酶以双链DNA为底物，环状和线性DNA均可作为底物，在合适的反应条件下，是两条核糖链上特定的磷酸二酯键断开，产生具有3’-OH和5’-P基团的DNA片段。

DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在电场作用下可以从负极向正极移动，相对分子质量越小，迁移越快，相对分子质量越大，迁移越慢。DNA的构想对迁移也有一定的影响，向阳极迁移的速度超螺旋大于线性，线性大于开环，电压在一定的范围线性DNA的迁移速率与所加的电压成正比。

一 细菌培养

操作方法： 培养基

培养基从形态上可分为液体培养基和固体培养基，根据有无抗生素和其他选择性药物又分为普通培养基与选择培养基。常用的培养基是以LB液体培养基为基础的各类选择性和非选择性培养基。

LB液体培养基： 胰化蛋白胨2.5g 酵母提取物1.25g 氯化钠2.5g 加水溶解，用5mol/LNaOH调节pH值到7.0。定容至250ml，高压灭菌20min。 固体培养基： 普通培养基

按LB配方配制液体培养基，加入琼脂（1.5%）高压灭菌20min，取出后在无菌条件下铺制平板。

②选择性培养基

将消毒好的固体培养基置于室温条件下，降温至50℃左右时无菌条件下加入抗生素或其他必须添加的成分，每毫升菌液加入氨苄青霉素贮存液（50mg/ml）1ul。摇匀后，再将菌液分别倒入已灭菌的平皿中，培养基厚度2-3mm，室温下固化。

细菌的培养

大多数大肠杆菌在保存培养基中存活数年，在-70℃低温箱或液氮中可长期保存。常用保存液为甘油（80%或100%）和DMSO溶液。

菌种复苏

无菌条件下用接种环或灭菌牙签挑取少许冻结的菌种接种到平皿上，37℃培养8-12小时。或按“3、小量培养”操作。

固体培养

用于单菌落或转化后抗性菌落的筛选。无菌条件下用接种环从冻存或新鲜的菌种中粘取少量菌液，点到平皿培养基的边缘上，以此为起点划一道划痕，接种环灭菌，交叉第一道划痕划一连续的波浪线，接种环灭菌，与第一条波浪线的最后划痕交叉划第二条波浪线，如此重复直至划满平板培养基，注意波浪线之间不能交叉重叠，37℃培养8-12小时。

小量培养

取灭菌试管加入3-5ml液体培养基和3-5ul氨苄青霉素溶液，用无菌牙签从固体培养基细菌平皿中挑取一单菌落接入液体培养基中，或取菌液5-10ul接入液体培养基，封口，37℃振荡培养6-12小时。

大量培养

已灭菌的500ml三角瓶中加入100-200灭菌的液体培养基及相应量的氨苄青霉素溶液，0.5%-1%的浓度接入菌液，封口，37℃振荡培养至OD600nm0.6-0.8。

二、碱裂解法提取质粒DNA

一．试剂

STE溶液：含0.1M NaCl，0.1M Tris·HCl（pH8.0），0.001M EDTA（pH8.0）的溶液，高压蒸汽灭菌。（50ml）

溶液Ⅰ：含005M葡萄糖，0.025M Tris·HCl（pH8.0），0.01M EDTA（pH8.0）的溶液，储存于4℃。（50ml） 溶液Ⅱ：含0.2M NaOH,1%SDS的溶液，先配制0.4M NaOH（现配现用，不用灭菌）和2% SDS（十二烷基磺酸钠）取0.4M NaOH和2% SDS按1:1（V：V）的比例混匀。（现配现用，不用灭菌）（50ml） 溶液Ⅲ：称取29.4g KAc 溶于80ml双蒸水，加入11.7ml冰醋酸后再定容至100ml。高压蒸汽灭菌，储存于4℃。（100ml）

酚/氯仿/异戊醇混合液（25:24:1，V：V：V）：将10ml Tris 饱和酚/10ml氯仿/0.4ml异戊醇按比例混匀。 70%乙醇（50ml）、无水乙醇（50ml）（-20℃预冷） RNA酶液20mg/mg(0.5ml)（用时稀释1000倍） 二．操作方法 A 细菌的收获

1．取1.5ml培养物到Ep管中，用微量离心机以12000g，离心30秒钟，吸去培养液，用1mlSTE溶液先沉淀一次（即用STE溶液重悬菌体沉淀，12000g离心30秒钟，弃去上清液）。 B 碱裂解法提取质粒：

1 将细菌沉淀重悬于100?L预冷的溶液Ⅰ中，振荡器上剧烈振荡混匀。

2 加入200?L新配制的溶液Ⅱ，盖紧管口，快速颠倒离心管5次以混匀，不要振荡。将离心管至于冰上5分钟。

3 加入150?L预冷的溶液Ⅲ盖紧管口，倒置后温和的振荡10秒，使溶液分散均匀，之后将离心管至于冰上3-5分钟。

4 4℃，12000g，离心5分钟，上清液转入另一新管中。

5 加等量的苯酚-氯仿-异戊醇混合溶液，振荡1-2分钟。4℃，12000g，离心2分钟，上清液转移到一新管中。

6 重复第5步。

7 加入2倍体积-20℃冰乙醇，-20℃保温20分钟以沉淀DNA。

8 4℃，12000g，离心5分钟，小心吸取上清液，将管倒置于吸水纸上，除尽管壁上的液滴。

9 用1ml4℃的70%乙醇洗沉淀，按步骤8除去上清液，在空气中干燥10分钟以上（使乙醇完全挥发）

10 用50?L含胰RNA酶的水（RNA酶终浓度20?g/mL，无DNA酶）重溶DNA，37℃水浴保温30分钟。所得质粒DNA溶液于紫外分光光度计测定含量后-20℃保存。

三、质粒DNA的酶切

实验目的

从上一实验，我们已提取到纯化的、符合酶切要求并已知其浓度的质粒。本实验的目的是为了选择合适的限制性内切酶对质粒进行酶切，产生粘性末端，为以后利用T4DNA连接该质粒和某外源DNA片段的对应粘性末端从而实现DNA的体外重组做准备。 实验原理

限制性内切酶

限制性内切酶（Restriction endonuclease）是一类识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并使每条链的一个二磷脂键断开的内脱氧核糖核酸酶（endo-doxyribonuclease）。限制性内切酶的命名一般以提取这种内切酶的生物的属名、种名和菌株（型）代号的字母缩写来命名。例如，从Haemophilus influenzae Re中提取的一种限制性内切酶被命名为Hind，并且由于同一菌株中提取到多种限制性内切酶，所以把提取到的第三种限制性内切酶以罗马数字表示，即HindⅢ。

限制性内切酶识别序列指限制性内切酶在双链DNA分子上识别的特殊核苷酸序列，可能是4,5,6甚至超过6个核苷酸，各种限制性内切酶识别序列具有一个共同的特点，即呈重旋转对称。

一般来说，同一种DNA分子中，识别序列断的，出现几率大，识别序列长的，出现几率小。如HindⅢ的识别序列为6个核苷酸对，在一段只含CTAG的DNA中，间隔4096（46）个核苷酸对才有一次机会出现这个识别序列。因此，要获得不同学长短的DNA片段，就得用识别序列长短不同的限制内切酶。但未必都具有这样的规律。往往识别序列富含AT的限制性内切酶在富含AT的DNA分子上出现几率较高，相反在富含GC的DNA分子上出现几率较少。识别序列富含GC的限制性内切酶亦然。

（二）限制性内切酶反应原理 限制性内切酶以双链DNA为底物，环形和线形DNA均可作为底物。在合适的反应条件下，是两条核糖链上特定位置的磷酸二酯键断开，产生具有3’-OH和5’-P基团的DNA片段。

限制性内切酶产生的DNA片段末端通常有两种形式：其一，两条链的断裂位置是交错的，形成具有凸出末端的DNA片段，这样的末端称之为 粘性末端。有的内切酶切割后产生3’粘性末端，即切割片段末端的3’比5’端多1到几个核苷酸；而另一些限制性内切酶切割后产生5’粘性末端。其二，两条链上的断裂位置处在识别序列的对称结构中心，这样断裂的结果形成具有平末端的DNA片段。 几个定义：具多识别序列的限制性内切酶

同裂酶（isoschizomer）

稀切限制性内切酶(稀切酶rare cutting enzymes) 同尾酶(isocaudamer) （三）反应系统 1、底物DNA

1)侧面序列和位点偏爱（Site Preferences）：经实验只含识别序列的寡核苷酸是不会被限制性内切酶切割的。大概在识别序列两端各伸展1或2个核苷酸，就可被低效切割，只有当侧面序列增加到一定长度后，才能达到正常的反应速率。并且侧面序列中的碱基组成对于个别切割位点的切割效率也有影响。有些酶有位点偏爱现象，这种现象被认为与不同位点的识别序列的侧面序列不同有关。 2）DNA的甲基化：制备的DNA样品往往在特定的核苷酸碱基对上被甲基化酶甲基化，一旦在识别序列中的核苷酸碱基被甲基化，则严重影响切割效率，但并不是所有的限制性内切酶都受甲基化序列的抑制。此外，限制性内切酶切割线性DNA分子的效果高于切割超螺旋DNA或病毒DNA。

3）DNA纯度：在DNA样中若含有一定量的DNase、蛋白质、乙醇、EDTA、SDS、酚、氯仿和高浓度的盐离子，均会影响限制性内切酶的切割效率。在纯度不高的情况下，增加酶用量，扩大反应体系体积，延长反应时间和加入阳离子亚精胺可以提高效率。 2、酶的用量

由于限制性内切酶的储存缓冲液中含有50%的甘油，所以酶的用量不得超过反应体系总体积的10%，使反应体系中甘油的浓度低于5%，并且酶用量还与底物DNA的量和酶液活性单位以及识别序列密切相关。

等量的两种DNA，由于含同种限制性内切酶的识别序列密度不同则酶量也不一样。

反应温度

大多数限制性内切酶的最适反应温度是37℃，但少数酶的最适反应温度低于或高于37℃，如TaqⅠ是65℃高于或低于最适温度就会降低酶活性。 反应的缓冲系统

限制性内切酶反应体系中一般仅有MgCl2，NaCl（KCl）,Tris-HCl和β-巯基乙醇（或二硫苏糖醇） 终止酶反应

向酶反应系统中加入EDTA（加入的EDTA会影响后续连接酶反应，因此用此法终止酶切反应后必须重新用酚-氯仿提取DNA）也可以对系统进行加热（一般为65℃10min就可以使大部分的酶丧失活性）。 星号活性现象

具有星号活力的酶在非标准反应的条件下，可能识别切割与其特异性识别序列不同但相似的位点。产生的原因：

（1）反应系统中的甘油的浓度高于（>5%）。 （2）酶用量过大

（3）离子浓度过低（<25mM） （4）高pH值（>8.0）

（5）含有有机溶剂（乙醇 二甲基亚砜）

（6）存在一些二价金属离子（如Cu2+、Co2+、Zn2+等，但不包括Mg2+） （7）反应时间过长