目 录
实验一 微生物制片及形态观察 ...............................................................................1
一、显微镜油镜的使用 ........................................................................................ 1 二、细菌简单染色法及形态观察 ........................................................................ 3 三、革兰氏染色法 ................................................................................................ 6 四、细菌的芽孢染色 ............................................................................................ 8 五、放线菌的形态结构观察 .............................................................................. 10 六、霉菌的形态结构观察 .................................................................................. 11 七、酵母菌的形态结构观察 .............................................................................. 12 实验二 微生物显微计数及活菌观察 .................................................................... 13
一、血球计数板的使用及酵母菌的显薇计数（暗视野） .............................. 13 二、大肠杆菌活菌的运动观察 .......................................................................... 15 三、放线菌及霉菌的水悬液观察 ...................................................................... 17 实验三 培养基的配制及灭菌 ................................................................................ 18
一、培养基的常规配制程序 .............................................................................. 19 二、细菌、放线菌常用培养基的配制 .............................................................. 24 三、酵母菌、霉菌常用培养基的配制 .............................................................. 26 四、高压蒸汽灭菌 .............................................................................................. 27 实验四 微生物的分离与纯化 ................................................................................ 31
一、微生物的接种技术 ...................................................................................... 31 二、土壤中细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的分离与纯化 .............................. 36 实验五 环境因素对微生物生长的影响 ................................................................. 46 实验六 微生物深层培养生产α-淀粉酶及其酶活测定......................................... 48 实验七 链霉素发酵及管碟法测定生物效价微生物发酵 .................................... 51 实验八 硫酸二乙酯对枯草芽孢杆菌产生α-淀粉酶的诱变效应......................... 56 附 15升发酵罐操作示范 ........................................................ 错误！未定义书签。
实验一 微生物制片及形态观察
一、显微镜油镜的使用
显微技术是微生物检验技术中最常用的技术之一。显微镜的种类很多，在实验室中常用的有：普通光学显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜、荧光显微镜和电子显微镜等。
1. 结构
光学显微镜是由光学放大系统和机械装置两部分组成。光学系统一般包括目镜、物镜、聚光器、光源等；机械系统一般包括镜筒、物镜转换器、镜台、镜臂和底座等（图1－1）。
图1－1 光学显微镜结构图
标本的放大主要由物镜完成，物镜放大倍数越大，它的焦距越短。焦距越小，物镜的透镜和玻片间距离（工作距离）也小。油镜的工作距离很短，使用时需格外注意。目镜只起放大作用，不能提高分辨率，标准目镜的放大倍数是十倍。聚光镜能使光线照射标本后进入物镜，形成一个大角度的锥形光柱，因而对提高物镜分辨率是很重要的。聚光镜可以上下移动，以调节光的明暗，可变光栏可以调节入射光束的大小。
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显微镜用光源，自然光和灯光都可以，以灯光较好，因光色和强度都容易控制。一般的显微镜可用普通的灯光，质量高的显微镜要用显微镜灯，才能充分发挥其性能。有些需要很强照明，如暗视野照明、摄影等，常常使用卤素灯作为光源。
2. 原理
显微镜的放大效能（分辨率）是由所用光波长短和物镜数值口径决定，缩短使用的光波波长或增加数值口径可以提高分辨率，可见光的光波幅度比较窄，紫外光波长短可以提高分辨率，但不能用肉眼直接观察。所以利用减小光波长来提高光学显微镜分辨率是有限的，提高数值口径是提高分辨率的理想措施。要增加数值口径，可以提高介质折射率，当空气为介质时折射率为1，而香柏油的折射率为1.51，和载片玻璃的折射率（1.52）相近，这样光线可以不发生折射而直接通过载片、香柏油进入物镜，从而提高分辨率。显微镜总的放大倍数是目镜和物镜放大倍数的乘积，而物镜的放大倍数越高，分辨率越高。
3. 使用方法 1）低倍镜观察
先将低倍物镜的位置固定好，然后放置标本片，转动反光镜，调好光线，将物镜提高，向下调至看到标本，再用细调对准焦距进行观察。除少数显微镜外，聚光镜的位置都要放在最高点。如果视野中出现外界物体的图像，可以将聚光镜稍微下降，图像就可以消失。聚光镜下的虹彩光圈（即可变光栏）应调到适当的大小，以控制射入光线的量，增加明暗差。
2）高倍镜观察
显微镜的设计一般是共焦点的，低倍镜对准焦点后，转换到高倍镜基本上也对准焦点，只要稍微转动微调即可。转换物镜后，要同时调节虹彩光圈的大小，使之与所使用物镜放大倍数相同的刻度。稍微上下移动聚光镜，观察图像是否清晰。
3）油浸镜观察
油浸镜的工作距离很小，所以要防止载皮片和物镜上的透镜损坏。使用时，一般是经低倍、高倍到油浸镜。当高倍物镜对准标本后，再加油浸镜观察。载玻片标本也可以不经过低倍和高倍物镜，直接用油浸镜观察。显微镜有自动止降装置的，载玻片上加油以后，将油浸镜下移到油滴中，到停止下降为止，然后用微调向上调准焦点。没有自动止降装置的，对准焦点的方法是从显微镜的侧面观察，将油浸镜下移到与载玻片稍微接触为止，然后用微调向上提升调准焦点。
使用油浸镜时，镜台要保持水平，防止油流动。油浸镜所用的油要洁净，聚光镜要提高到最高点，并放大聚光镜下的虹彩光圈，否则会降低数值口径而影响分辨率。无论是油浸镜或高倍镜观察，都宜用可调节的显微镜灯作光源。
4. 注意事项
显微镜是精密贵重的仪器，必须很好地保养。显微镜用完后要放回原来的镜箱或镜柜中，同时要注意下列事项：
1）观察完后，移去观察的载玻片标本。
2）用过油浸镜的，应先用擦镜纸将镜头上的油擦去，再用擦镜纸蘸着二甲苯擦拭2—3次，最后再用擦镜纸将二甲苯擦去。 3）转动物镜转换器，放在低倍镜的位置。
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4）将镜身下降到最低位置，调节好镜台上标本移动器的位置，罩上防尘套。 镜头的保护最为重要。镜头要保持清洁，只能用软而没有短绒毛的擦镜纸擦拭。擦镜纸要放在纸盒中，以防沾染灰尘。切勿用手绢或纱布等擦镜头。物镜在必要时可以用溶剂清洗，但要注意防止溶解固定透镜的胶固剂。根据不同的胶固剂，可选用不同的溶剂，如酒精、丙酮和二甲苯等，其中最安全的是二甲苯。方法是用脱脂棉花团蘸取少量的二甲苯，轻擦，并立即用擦镜纸将二甲苯擦去，然后用洗耳球吹去可能残留的短绒。目镜是否清洁可以在显微镜下检视。转动目镜，如果视野中可以看到污点随着转动，则说明目镜已沾有污物，可用擦镜纸擦拭接目的透镜。如果还不能除去，再擦拭下面的透镜，擦过后用洗耳球将短绒吹去。在擦拭目镜或由于其他原因需要取下目镜时，都要用擦镜纸将镜筒的口盖好，以防灰尘进入镜筒内，落在镜筒下面的物镜上。
二、细菌简单染色法及形态观察
运用普通光学显微镜来进行微生物形态学特征的观察是实验室常用方法，然而，微生物（尤其是细菌）细胞小而透明，当把细菌悬浮于水滴内，用光学显微镜观察细菌时，由于菌体和背景没有显著的明暗差，因而难以看清它们的形态，更不易识别其结构，所以，用普通光学显微镜观察细菌时，往往要先将细菌进行染色，借助于着色的反衬作用，可以更清楚地观察到细菌的形状及某些细胞结构，因此，为了研究微生物的形态特征和鉴别不同类群的微生物，微生物的染色及形态结构的观察是微生物学实验中十分重要的基本技术。
用于微生物染色的染料，是一类苯环上带有发色基团和助色基团的有机化合物。发色基团赋予化合物的颜色特征，助色基团则给予化合物能够形成盐的性质，仅含发色基团的苯化合物（称色原）即使带有颜色也不能作为染料，因为它不能电离，不能与酸或碱形成盐，对微生物（或其他材料）没有结合力，很容易被洗脱或机械方法除去。染料通常都是盐，分酸性染料和碱性染料两大类。在微生物染色中，碱性染料较常用，如常用的美蓝（即亚甲蓝）、结晶紫、碱性复红、蕃红（即沙黄）、孔雀绿等都属碱性染料。
这部分实验着重于细菌的染色观察，同时也进行放线菌、酵母菌和丝状真菌的形态学观察。其目的是使同学在掌握细菌染色观察技术的基础上，了解其他微生物形态结构的观察方法；初步认识各类微生物的形态特征，巩固课堂知识，增强感性认识。
（一）目的要求
学习微生物涂片、染色的基本技术，掌握细菌的简单染色法。 初步认识细菌的形态特征。
巩固显微镜（油镜）的使用方法和无菌操作技术。
（二）基本原理
简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。此法操作简便，适用于菌丝体一般形状和细菌排列的观察。
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常用碱性染料进行简单染色，这是因为：在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷（酸性染料电离时，其分子的染色部分带负电荷），因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色。经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。常用作简单染色的染料有：美蓝、结晶紫、碱性复红等。
石碳酸复红染色液着色快，时间短，菌体呈红色；美蓝染色液着色慢，时间长，效果清晰，菌体呈兰色；草酸铵结晶紫染色液染色迅速，着色深，菌体呈紫色。
当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，此时可用伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料染色。
（三）实验材料
1．菌种：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的斜面培养物。
2．染色剂：吕氏碱性美蓝染液（或草酸铵结晶紫染液），齐氏石炭酸复红染液。 3．仪器或其它用具：显微镜，酒精灯，载玻片，接种环，双层瓶（内装香柏油和二甲苯），擦镜纸，生理盐水等。
（四）实验步骤 1． 涂片
取两块载玻片，各滴一小滴（或用接种环挑取1～2环）生理盐水（或蒸馏水）于玻片中央，用接环以无菌操作的方法，分别从以上菌种斜面上挑取少许菌苔于水滴中，混匀并涂成薄膜。若用菌悬液（或液体培养物）涂片，可用接种环挑取2～3环直接涂于载玻片上（图1－2）。
载玻片要洁净无迹；滴生理盐水和取菌不宜过多；涂片要涂抹均匀，不宜过厚。 2． 干燥
室温自然干燥或烘干。 3． 固定
涂面朝上，通过火焰2～3次。
此操作过程称热固定，其目的是使细胞质凝固，以固定细胞形态，并使之牢固附着在载玻片上；同还可以杀死菌体；增加菌体与染料的结合力。热固定温度不宜过高（以玻片背面不烫手为宜），否则会改变甚至破坏细胞形态。
4． 染色
将玻片平放于玻片搁架上，滴加染液于涂片上（染液刚好覆盖涂片薄膜为宜）。草酸铵结晶紫染色约1 min，或吕氏碱性美蓝、或石炭酸复红染色1～2 min。
5． 水洗
倒去染液，用自来水冲洗，直至涂片上流下的水无色为止。水洗时，不要直接用水冲洗涂面，而应使水从载玻片的一端经涂面流向另一端，水流不宜过急、过大，以免涂片薄膜脱落。
6． 干燥
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自然干燥，或用吸水纸吸干，也可烘干。 7． 镜检
涂片干后镜检。涂片必须完全干燥后才能用油镜观察。
图1－2 简单染色无菌操作及涂片、干燥和热固定过程
图片说明：1.取接种环；2.将接种环放在酒精灯上灼烧；3.摇匀菌液；4.灼烧试管口；5a5b.取菌液或从斜面上取菌苔；6取菌完毕，再烧试管口，塞上棉塞；7a7b.涂片，从斜面上取的菌与载玻片的水滴混匀后涂片；8.涂片完毕，灼烧接种环；9.固定；10.染色；11.水洗；12.吸干
（五）实验报告内容
根据观察结果，绘出两种细菌的形态图。
（六）思考题
1. 你认为制备细菌染色标本时，尤其应该注意哪些环节？ 2. 为什么要求制片完全干燥后才能用油镜观察？
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3. 如果你的涂片未经热固定，将会出现什么问题？如果加热温度过高、时间太长，又会怎样呢？
三、革兰氏染色法
（一）目的要求
学习并初步掌握革兰氏染色法。
了解革兰染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。
（二）基本原理
革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家Christsin Gram氏创立，而后一些学者在此基础上作了些改进。革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法。
革兰氏染色法的基本步骤是：先用初染剂结晶紫进行染色，再用碘液媒染，然后用乙醇（或丙酮）脱色，最后用复染剂（如蕃红）复染。经此方法染色后，细胞保留初染剂蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌；如果细胞中初染剂被脱色而使细菌染上复染剂的颜色（红色），该菌属于革兰氏阴性菌。
革兰氏染色法将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性，是由这两类细胞壁的结构和组成不同决定的。实际上，当用结晶紫初染后，像简单染色法一样，所有细菌都被染成初染剂的蓝紫色。碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成结晶紫－碘的复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。当用脱色剂处理时，两类细菌的脱色效果不同的。革培养氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成、壁厚、类脂质含量低，用乙醇（或丙酮）脱色时细胞壁脱水、使肽聚糖形成的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫—碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。革兰氏阴性菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄、类脂含量较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。现在一般认为革兰氏阳性菌体内含有特殊的核蛋白质镁盐与多糖的复合物，它与碘和结晶紫的复合物结合很牢，不易脱色，阴性菌复合物结合程度底，吸附染料差，易脱色。
另外，阳性菌菌体等电点较阴性菌为低，在相同pH条件下进行染色，阳性菌吸附碱性染料很多，因此不易脱去，阴性菌则相反。所以染色时的条件要严格控制。例如，在强碱的条件下进行染色，两类菌吸附碱性染料都多，都可呈正反应；pH很低时，则可都呈负反应。
革兰氏染色反应是细菌重要的鉴别特征，为保证染色结果的正确性，采用规范的染色方法是十分必要的。本实验将介绍被普遍采用的Hucker氏改良的革兰氏染色法。
（三）实验材料
1．菌种：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的斜面培养物。 2．染色剂：革兰氏染色液。 3．仪器或其他用具同实验一。
（四）实验步骤
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1．制片
取菌种培养物按常规涂片、干燥、固定。 性；火焰固定不宜过热（以玻片不烫手为宜）。 2．初染
滴加结晶紫（以刚好将菌膜覆盖为宜）染色1～2 min,水洗。 3．媒染
用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约1min，水洗。 4．脱色
用吸水纸吸去载玻片上的残水，将载玻片倾斜，在白色背景下，用滴管流加95%的乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗。 革兰氏染色结果是否正确，乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节。脱色不足，阴性菌被误染成阳性菌，脱色过度，阳性菌被误染成阴性菌。脱色时间一般约20～30s。 5．复染
用蕃红液复染约2 min，水洗。 6．镜检
干燥后，用油镜观察。菌体被染成蓝色的是革兰氏阳性菌，被成红色的为革兰氏阴性菌。 7．混合涂片染色
按上述方法，在同一载玻片上，以大肠杆菌和金黄色葡萄菌作混合涂片、染色、镜检进行比较。
（五）实验报告内容
列表简述2株细菌的染色观察结果（说明各菌的形状、颜色和革兰氏染色反应）。
（六）思考题
1．你认为哪些环节会影响革兰氏染色结果的正确性？其中最关键的环节是什么？ 2．现有一株细菌宽度明显大于大肠杆菌的粗壮杆菌，请你鉴定其革兰氏染色反应，你怎样运用大肠杆菌和金黄色葡萄球为对照菌株进行涂片染色，以证明你的染色结果正确性。 3．你的染色结果是否正确？如果不正确，请说明原因。
4．进行革兰氏染色时，为什么特别强调菌龄不能太老，用老龄细菌染色会出现什么问题？
5．革兰氏染色时，初染前能加碘液吗？乙醇脱色后复染之前，革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌应分别是什么颜色？
6．你认为革兰氏染色中，哪一个步骤可以省去而不影响最终结果？在什么情况下可以采用？
要用活跃生长期的幼龄培养物作革兰氏染色；涂片不宜过厚，以免脱色不完全造成假阳
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图1－3 革兰氏阴性杆菌和革兰氏阳性杆菌染色效果
四、细菌的芽孢染色
（一）目的要求
学习并掌握芽孢染色法。 初步了解芽孢杆菌的形态特征。
（二）基本原理
芽孢又叫内生孢子（endospore）是某些细菌生长到一定阶段在菌体内形成的休眠体，通常呈圆形或椭圆形。细菌能否形成芽孢以及芽孢的形状、芽孢在芽孢囊内的位置以及芽孢囊是否膨大等特征是鉴定细菌的依据之一。
由于芽孢壁厚、透性低、不易着色，当用石炭酸复红、结晶紫等进行单染色时，菌体和
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芽孢囊着色，而芽孢囊内的芽孢不着色或仅显很淡的颜色，游离的芽孢呈淡红或淡蓝紫色的圆或椰圆形的圈。为了使芽孢着色便于观察，可用芽孢染色法。
芽孢染色法的基本原理是：用着色力强的染色剂孔雀绿或石炭酸复红，在加热条件下染色，使染料不仅进入菌体也可进入芽孢内，进入菌体的染料经水洗后被脱色，而芽孢一经着色难以被水洗脱， 当用对比度大的复染剂染色后，芽孢仍保留初染剂的颜色，而菌体和芽孢囊被染成复染剂的颜色，使芽孢和菌体更易于区分。
（三）实验材料 1．菌种
枯草芽孢杆菌的斜面培养物。 2．染色剂
5%孔雀绿溶液，0.5%蕃红水溶液。 3．仪器或其它用具
小试管，滴管，烧杯试管架，载玻片，木夹子，显微镜等。
（四）实验步骤
1）制片：按常规涂片、干燥、固定。
2）染色：加数滴孔雀绿染液于片上，用木夹夹住载玻片一端，在微火上加热至染料冒蒸气并开始计时，维持5min。加热过程中，要及时补充染液，切勿让涂片干涸。
3）水洗：待玻片冷却后，用缓流自来水冲洗，直至流出的水无色为止。勿用瀑水对着菌膜冲洗，以免细菌被水冲掉。
4）复染：用番红染液复染2 min 。 5）水洗：用缓流水洗后，吸干。
6）镜检：干后油镜观察。芽孢呈绿色，芽孢囊及营养体为红色。
（五）实验报告内容
绘图表示枯草芽孢杆菌的形态特征（注意芽孢的形状、着生位置及芽孢囊的形状特征。）
（六）思考题
1. 说明芽孢染色法的原理。用简单染色法能否观察到细菌的芽孢？
2. 用Schaeffer-Fulton氏染色法加热染色时，若因一时疏忽玻片上的染液被烘干，此时能否立即补加染液？为什么？
3. 若涂片中观察到的只是大量游离芽孢，很少看到芽孢囊及营养细胞，你认为这是什么原因？
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五、放线菌的形态结构观察
（一）目的要求
学习并掌握放线菌形态结构的观察方法。
观察放线菌的菌落特征、个体形态及其繁殖方式。
（二）基本原理
放线菌的菌落在培养基上着生牢固，与基质结合紧密，难以用接种针挑取。
放线菌细胞一般呈分枝无隔的丝状，纤细的菌丝体分为在培养基内部的基内菌丝和伸出培养基表面的气生菌丝。气生菌丝上部分化成孢子丝，呈螺旋状、波浪状，或分枝状等，其着生的形式也有所不同。菌丝呈各种颜色，有的还能分泌水溶性色素到培养基内。孢子丝长出孢子，孢子的形状多种多样，表面结构各异，孢子也具各种颜色。由于大量孢子的存在，使菌落表面呈现干粉状，从菌落的形态特点容易同其他类微生物区分开来。这些形态特点都是菌种鉴定和分类的重要依据。
（三）实验材料 1．菌种
灰色链霉菌（培养好的菌落平板及菌苔斜面）。 2．其它物品
载玻片及盖玻片、0.1％美蓝染液。
（四）实验步骤 1．个体形态特征的观察
用接种铲取下一小菌苔的一薄层培养基，平置于载玻片上，然后分别在低倍镜和高倍镜下观察。注意放线菌菌丝直径的大小，孢子丝的形状。哪种菌的孢子丝呈螺旋状？
2. 孢子形状的观察
以无菌操作用接种环分别取少许灰色链霉菌涂布于载玻片上。在载玻片上加一小滴0.1%美蓝染液，将盖玻片轻轻盖在染液上，注意不要有气泡，吸水纸吸去多余的染液，在高倍镜下观察孢子丝及孢子的形态，有些制片也能观察到无隔的气生菌丝。
（五）实验报告内容
1. 描述你所观察到的放线菌菌落特征。
2. 绘图：灰色链霉菌和淡紫灰链霉菌的气生菌丝、孢子丝及孢子的形态。 （六）思考题
1. 放线菌为何属于原核微生物？
2. 放线菌与细菌菌落最显著的差异是什么？
图1－4 放线菌菌丝形态
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六、霉菌的形态结构观察
（一）目的要求 观察霉菌菌落特征。
学习并掌握霉菌的制片方法。 观察霉菌的个体形态。
（二）基本原理
霉菌是由许多交织在一起的菌丝体构成。在潮湿条件下，生长繁殖长出丝状、绒毛状或蜘蛛网状的菌丝体，并在形态及功能上分化成多种特化结构。菌丝在显微镜下观察呈管状，有的有横隔，将菌丝分割为多细胞（如青霉、曲霉），有的菌丝没有横隔（如毛霉、根霉）。菌丝的直径比一般细菌和放线菌菌丝大几倍到十几倍。菌落形态较大，质地较疏松，颜色各异。菌丝体经制片后可用低倍或高倍镜观察。在观察时要注意菌丝直径的大小，菌丝体有无隔膜，营养菌丝有无假根，无性繁殖或有性繁殖时形成的孢子种类及着生方式。
（三）实验材料 1．菌种
黑曲霉、毛霉的斜面培养物。 2．其它物品
蒸馏水、载玻片、盖玻片等。
（四）实验步骤 个体形态特征的观察：
于洁净的载玻片中央，滴加一小滴蒸馏水，然后用接种针从菌苔边缘挑取少许菌丝体置于其中，使其摊开，轻轻盖上盖玻片（注意勿出现气泡），置于低倍镜、高倍镜下观察。
1）观察黑曲霉菌丝体有无横隔、足细胞，注意分生孢子梗、顶囊、小梗及分生孢子着
生状况及形状。
2）观察毛霉的无横隔菌丝（注意菌丝内常有气泡，不是横隔）、孢子囊柄、孢子囊及孢囊孢子。孢囊破裂后能观察到囊托及囊轴。
（五）实验报告内容
绘制黑曲霉、毛霉的个体形态图。
（六）思考题
总结在显微镜下看到的黑曲霉、毛霉个体形态上的异同。
图1－5 霉菌菌丝形态结构（隔膜）
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七、酵母菌的形态结构观察
（一）目的要求
观察并掌握酵母菌的菌落特征、个体形态、生长及繁殖方式。
（二）基本原理
酵母菌细胞的个体形态、繁殖方式及菌落特征。
在光学显微镜下，大多数酵母菌为单细胞，一般呈卵圆形、圆形、圆柱形或柠檬形。大小约为1～5×5～30μm、，最大可达100μm。各种酵母菌有其一定的大小和形态，但也随菌龄和环境条件而异；即使在纯培养中，各个细胞的形状、大小亦有差别。有些酵母菌细胞与其子代细胞连在一起成为链状，成为假丝酵母。大多数酵母在平板培养基上形成的菌落较大而厚，湿润、较光滑，颜色较单调（多为乳白色，少有红色，偶见黑色）。酵母细胞核与细胞质有明显的分化，个体直径比细菌大几倍到十几倍。繁殖方式也较复杂，无性繁殖主要是出芽生殖，有些酵母能形成假菌丝。有性繁殖是通过接合形成子囊及子囊孢子。
观察酵母菌个体形态时，应注意其细胞形状；无性繁殖是芽殖或裂殖，芽体在母体细胞上的位置，有无假菌丝等特征；有性繁殖形成的子囊和子囊孢子的形状及数目。
（三）实验材料 1．菌种 酿酒酵母。 2．染液及溶液
7.6%孔雀绿染液，0.5%蕃红染液。 3．其它物品 载玻片及盖玻片等。 （四）实验内容
个体形态特征与出芽繁殖的观察： 酵母细胞较大，用水浸片法观察，即在载玻片中央滴加一小滴无菌水或滴加0.1%美蓝液一小滴，无菌操作用接种环取酿酒酵母少许（并注意酵母菌与培养基结合是否紧密），置于无菌水或美蓝液中，使菌体与其混合均匀。将盖玻片
斜置轻轻盖在液滴上。制片先用低倍镜，再换高倍镜观察酵母细胞的形状及出芽方式。
（五）实验报告内容
绘图：酿酒酵母的菌体、出芽方式。
（六）思考题
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图1－5 酵母菌形态结构（箭头示出芽细胞）
1. 酵母菌和细菌细胞在形态、结构上有何区别？
2. 在同一平板培养基上若同时有细菌及酵母菌两种菌落，如何识别。 3. 细菌、放线菌、霉菌及酵母菌菌落特征如何识别？个体形态有何差别？
实验二 微生物显微计数及活菌观察
一、血球计数板的使用及酵母菌的显微计数（暗视野）
（一） 实验目的 学习血球计数板的使用。
直接计数法测定样品中酵母细胞数。
（二）实验原理
利用血球计数器在显微镜下直接计数是一种常见的微生物计总数的方法。因为计数器载片和盖片间的容积一定，所以可以根据显微镜下观察到的微生物数目来计算单位体积内微生物总数。
图2－1 两种血球计数板
血球计数器是一只特制载玻片。载片上有两个方格网，每一方格网共分九个大方格，其中间的一个大方格用来做微生物计数，所以又称为计数室。计数室的刻度一般有两种，一种是每个大方格分成16个中方格，每中方格又分成25个小方格（麦氏血细胞计数板）。另一种是一个大方格分25个中方格，每个中方格又分成16个小方格（希里格血细胞计数板。但
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是不论哪一种，一个大方格，都等分成（25×16或16×25）400个小方格。（图2－1）因为每个大方格边长为1毫米，载片与盖片间距离为0.1毫米，所以每个计数室（1个大方格）体积为0.1立方毫米。测出每个中方格菌数，就可以算出一个大方格的菌数，由此推算出1毫升菌液内所含的菌数。
（三）实验材料 1. 器材
血球计数板、计数器、显微镜。 2. 菌种 酿酒酵母菌液。
（四）操作步骤 1. 血球计数板的操作
1） 取一个清洁的血球计数板，将洁净的专用盖玻片放置在计数室上；
2） 把在液体培养基上室温培养了24～48h的酿酒酵母菌悬液进行稀释，以每小格有
3～5个酵母菌为宜；
3） 摇匀稀释的酵母菌液，用无菌滴管吸取少许菌液，沿盖玻片的边缘滴一小滴（不宜
太多），使菌液自行渗入计数室（两个计数室各滴一滴；注意：加菌液时不得使计数室内有气泡），静置5 min；
4） 将计数板放置在显微镜的载物台上，先在低倍镜下找到方格网，然后转到高倍镜下
进行观察和计数。 2. 计数方法
1） 不同规格的计数板的计数方法略有差异，一个大方格是16个中方格的（16×25），
应当数4角4个中方格（即100个小方格）的菌数；一个大方格是25个中方格的（25×16），除取4角4个中方格外，还要数中央一个中方格（即为80个小方格）的菌数。注意：酵母菌的芽体达到母体细胞大小的一半者，即可作为两个菌体计数；位于两个中方格间线上的酵母菌，只统计此格的上侧和右侧线上的菌体数，即数上不数下，数左不数右；
2） 每个样品重复计数2～3次（每次计数结果不应相差太大，否则重新操作），求平
均值；
3） 按下列公式计算出每毫升菌液所含的酵母菌细胞数； 16×25计数板：
总菌数/ml?100个小方格内菌数100?400?10000?稀释倍数
＝每个小方格内菌数×4×106×稀释倍数
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25×16计数板：
总菌数/ml?80个小方格内菌数80?400?10000?稀释倍数
＝每小方格内菌数×4×106×稀释倍数
（五）实验报告内容
记录计数结果并计算出每毫升菌液中的酵母菌细胞数。
（六）思考题
1.在滴加菌液时，为什么要先盖上盖玻片后再滴加菌液？能否先滴加菌液再盖盖玻片？ 2.用血球计数板测定微生物数量时，哪些步骤易造成误差？如何预防？ 3.计数细菌数目时此法是否适用？
二、大肠杆菌活菌的运动观察
（一）实验目的
学习了解在暗视野中观察细菌的运动。
（二）实验原理
鞭毛（flagellum，复flagella）是生长在某些细菌体表的长丝状、波曲的蛋白质附属物，其数目为—至数十条，具有运动功能。鞭毛的长度一般为15～20μm，直径为0.01l～0.02μm。观察鞭毛最直接的方法是用电子显微镜，用特殊的鞭毛染色法使染料沉积在鞭毛上，加粗后的鞭毛也可用光学显微镜观察。在暗视野中，对水浸片或悬滴标本中运动着的细菌，也可根据其运动方式判断它们是否具有鞭毛。在下述两种情况下，单凭肉眼观察也可初步推断某细菌是否存在着鞭毛：①在半固体(含0.3％～0.4％琼脂)直立柱中用穿刺法接种某一细菌，经培养后，若在穿刺线周围有呈混蚀的扩散区，说明该菌具有运动能力，并可推测其长有鞭毛，反之，则无鞭毛；②根据某菌在平板培养基上的菌落外形也可推断它有无鞭毛，一般地说，如果该菌长出的菌落形状大、薄且不规则，边缘极不圆整，说明该菌运动能力很强，反之，若菌落外形圆整、边缘光滑、厚度较大，则说明它是无鞭毛的细菌。
原核微生物(包括古生菌)鞭毛的构造由基体、钩形鞘和鞭毛丝三部分组成。革兰氏阳性细菌和阴性细菌在基体的构造上稍有区别。革兰氏阴性细菌的鞭毛最为典型，现以大肠杆菌的鞭毛为例。它的基体(basal body)由四个盘状物即环(ring)组成，最外层的L环连在细胞壁最外层的外膜上，接着是连在肽聚糖内壁层的P环，第三个是靠近周质空间的S环，它与第四个环即M环连在一起称S－M环或内环，共同嵌埋在细胞质膜上。S－M环被一对Mot蛋白包围，由它驱动S—M环快速旋转。在S—M环的基部还存在一个Fli蛋白，起着键钮的作用，它可根据细胞提供的信号令鞭毛进行正转或逆转。目前已清楚地知道，鞭毛基体实为精致、超微型的马达，其能量来自细胞膜上的质子动势(proton motive potential)。据计算，
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鞭毛旋转一周约消耗1000个质子。把鞭毛基体与鞭毛丝连在一起的构造称钩形鞘或鞭毛钩(hook)，直径约17 nm，其上着生—条长约15～20μm的鞭毛丝(filament)。鞭毛丝是由许多直径为4.5 nm的鞭毛蛋白(flagellin)亚基沿着中央孔道(直径为2 nm)螺旋状缠绕而成，每周为8～10个亚基，鞭毛蛋白是一种呈球状或卵圆状蛋白，相对分子质量为3万～6万，它在细胞质内合成，由鞭毛基部通过中央孔道输送到鞭毛游离的顶部进行自装配。因此，鞭毛的生长方式是在其顶部延伸而非基部延伸。图2－2即为革兰氏阴性细菌鞭毛的构造模式图。革兰氏阳性细菌的鞭毛结构较为简单。枯草芽抱杆菌鞭毛的基体仅有S和M两个环，而鞭毛丝和钩形鞘则与革兰氏阴性菌相同。
图2－2 革兰氏阴性细菌鞭毛的构造
鞭毛的功能是运动，这是原核生物实现其趋性(taxis)即趋向性的最有效方式，其运动方式主要是作旋转运动。
鞭毛的着生方式有，端生、周生和侧生等三种类型。
（三）实验材料 1. 菌种 大肠杆菌。 2.实验器材
显微镜，血球计数板，载玻片，盖玻片，接种针。 （四）实验步骤
1. 取一洁净的血球计数板或载玻片； 2. 在载玻片上滴2～3滴无菌水；
3. 取接种环，灼烧，在试管斜面上取一环大肠杆菌，在滴有无菌水的载玻片上制成菌
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悬液；
4. 用滴管取一小滴滴在盖玻片上，并将盖玻片扣在血球计数板的凹槽上，或直接将盖
玻片盖在菌悬液上，放在显微镜下进行观察。
（五）实验报告内容 描述大肠杆菌的运动方式。
（六）思考题
为什么在显微镜下观察细菌运动要将可变光栏调到最小（暗视野）？
三、放线菌及霉菌的水悬液观察
（一）实验目的
观察了解不同菌丝的形态以及孢子的形态、着生方式。
（二）实验原理
放线菌细胞一般呈分枝无隔的丝状，菌丝体分为基内菌丝和气生菌丝。气生菌丝上部分化成孢子丝，呈螺旋状、波浪状，或分枝状等，其着生的形式也有所不同。菌丝呈各种颜色，有的还能分泌水溶性色素到培养基内。孢子丝长出孢子，孢子的形状多种多样，表面结构各异，孢子也具各种颜色。由于大量孢子的存在，使菌落表面呈现干粉状，从菌落的形态特点容易同其他类微生物区分开来。这些形态特点都是菌种鉴定和分类的重要依据。
图2－3 霉菌菌丝示意图
A无隔多核菌丝；B有隔单核菌丝；C有隔多核菌丝。
霉菌(mold)是一些“丝状真菌”的统称，不是分类学上的名词。霉菌菌体均由分枝或不分枝的菌丝(hypha)构成。许多菌丝交织在一起称为菌丝体(mycelium)。菌丝在光学显微镜下呈管状，直径约为2～10μm，比一般细菌和放线菌菌丝大几到几十倍。霉菌菌丝有两类(图2—3)：①无隔膜菌丝，整个菌丝为长管状单细胞，细胞质内含有多个核。其生长过程只表现为菌丝的延长和细胞核的裂殖增多以及细胞质的增加，如根霉、毛霉、犁头霉等。②有隔
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膜菌丝，菌丝由横隔膜分隔成成串多细胞，每个细胞内含有一个或多个细胞核。有些菌丝，从外观看虽然像多细胞，但横隔膜上有小孔，使细胞质和细胞核可以自由流通，而且每个细胞的功能也都相同，如青霉菌、曲霉菌、白地霉等绝大多数霉菌菌丝均属此类。
在固体培养基上，部分菌丝伸人培养基内吸收养料，称为营养菌丝；另一部分则向空中生长，称为气生菌丝。有的气生菌丝发育到—定阶段，分化成繁殖菌丝，即孢子丝。
（三）实验材料 1. 菌种
灰色链霉菌，黑曲霉，毛霉。 2. 实验器材
显微镜，载玻片，盖玻片，接种针。
（四）实验步骤
实验步骤同实验一放线菌和霉菌形态观察。
实验三 培养基的配制及灭菌
培养基是指利用人工方法将适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的各种营养物质混合配制而成的营养基质。主要用于微生物的分离、培养、鉴定以及菌种保藏等方面。培养基一般应含有微生物生长繁殖所需要的碳源、氮源、能源、无机盐、生长因子和水等营养成分。此外，为了满足微生物生长繁殖或积累代谢产物的要求，还必须控制培养基的pH。一般细菌、放线菌适于生长在中性或微碱性的环境中，而酵母菌和霉菌则适于生长在偏酸性的环境中。因此，在配制培养基时，须将培养基调节在一定pH的范围内。
迄今为止，培养基的种类极其繁多。按培养基的成分，可将培养基分为天然培养基、合成培养基和半合成培养基。
天然培养基是指利用动物、植物、微生物或其它天然有机成分配制而成的培养基。其优点是营养丰富、价格便易；缺点是成分不能准确确定且不稳定。实验室常用的牛肉汁或麦芽汁培养基即为天然培养基。
合成培养基是指完全利用已知种类和成分的化学试剂配制而成的培养基。优点是各成分均为已知且含量稳定，缺点是价格较贵。实验室常用的高氏一号培养基即为合成培养基。
半合成培养基是指由天然有机成分和已知化学试剂混合组成的培养基。实验室常用的马铃薯葡萄糖培养基即为半合成培养基。
按培养基的物理状态，可将培养基分为固体培养基、半固体培养基和液体培养基。固体培养基是指在液体培养基中加入一定量的凝固剂（常加1.5％～2％的琼脂）经融化冷凝而成；半固体培养基是指在液体培养基中加入0.2％～1％左右的琼脂，经融化冷凝而成；液体培养基是指培养基中不加凝固剂琼脂，培养基呈液体状态。
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按培养基的用途，可将培养基分为加富培养基、选择培养基和鉴别培养基。
加富培养基是指在培养基中加入某些特殊营养物质，促使某种持殊性能的微生物迅速生长，有利从混合菌群中分离出所需种类微生物。例如为了分离能够利用石蜡的微生物，常在培养基中加入石蜡作为碳源。
选择培养基是指在培养基中加入某些微生物生长抑制剂，抑制那些不需要的微生物的生长，以达到从混杂微生物菌群的环境中分离到所需的微生物。例如用于分离真菌的马丁培养基。
鉴别培养基是指在培养基中加入特定指示剂，它能与某一微生物的代谢产物产生显色反应，便于微生物的快速鉴定。例如用于鉴定大肠杆菌的伊红美蓝培养基。
本章着重介绍培养基的常规配制程序，培养细菌、放线菌、酵母菌和霉菌常用培养基的配制方法，以及几种常用选择培养基和鉴别培养基的配制方法。此外还介绍高压蒸汽灭菌法，它是微生物学实验中最常用也是最重要的灭菌方法。
一、培养基的常规配制程序
（一）目的要求
了解培养基配制过程各环节的要求和注意事项。
了解培养基的配制原理。
（二）基本原理
正确掌握培养基的配制方法是从事微生物学实验工作的重要基础。由于微生物种类及代谢类型的多样性，因而用于培养微生物培养基的种类也很多，它们的配方及配制方法虽各有差异。但一般培养基的配制程序却大致相同，例如器皿的准备，培养基的配制与分装，棉塞的制作，培养基的灭菌，斜面与平板的制作以及培养基的无菌检查等基本环节大致相同。
（三）实验材料 1. 药品
待配各种培养基的组成成分、琼脂、1mol/L NaOH溶液、1mol/L HCl溶液等。 2. 仪器
天平或台秤、高压蒸汽灭菌锅。 3. 玻璃器皿
移液管、试管、烧杯、量筒、锥形瓶、培养皿、玻璃漏斗等。 4. 其它物品
药匙、称量纸、pH试纸、记号笔、棉花、纱布、线绳、塑料试管盖、牛皮纸、报纸等。
（四）实验步骤 1. 玻璃器皿的洗涤
玻璃器皿在使用前必须洗刷干净。将锥形瓶、试管、培养皿、量筒等浸入含有洗涤剂的
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水中，用毛刷刷洗，然后用自来水及蒸馏水冲净。移液管先用含有洗涤剂的水浸泡，再用自来水及蒸馏水冲洗。洗刷干净的玻璃器皿置于烘箱中烘干后备用。详见附录一。
2. 灭菌前玻璃器皿的包装 (1) 培养皿的包装：培养皿由一盖一底组成一套。可用报纸将几套培养皿包成一包，或者将几套培养皿直接置于特制的铁皮圆筒内，加盖灭菌。包装后的培养皿须经灭菌之后才能使用。
(2) 移液管的包装：在移液管的上端塞入一小段棉花(勿用脱脂棉)，它的作用是避免外界及口中杂菌吹入管内，并防止菌液等吸入口中。塞入此小段棉花应距管口约0.5cm左右，棉花自身长度约1～1.5cm。塞棉花时，可用一外圈拉直的回形针，将少许棉花塞入管口内。棉花要塞得松紧适宜，吹时以能通气而又不使棉花滑下为准。
先将报纸裁成宽约5cm左右的
图3－1 单支移液管包扎方法 长纸条，然后将已塞好棉花的移液管尖端放在长条报纸的一端，约成45o角，折迭纸条包住尖端，用左手握住移液管身，右手将移液管压紧，在桌面上向前搓转，以螺旋式包扎起来。上端剩余纸条，折迭打结，准备灭菌(见图3－1)。
3. 液体及固体培养基的配制过程 1）液体培养基配制
称量：一般可用1/l00粗天平称量配制培养基所需的各种药品。先按培养基配方计算各成分的用量，然后进行准确称量。
溶化：将称好的药品置于一烧杯中，先加入少量水(根据实验需要可用自来水或蒸馏水)，用玻棒搅动，加热溶解。
定容：待全部药品溶解后，倒入一量筒中，加水至所需体积。如某种药品用量太少时，可预先配成较浓溶液，然后按比例吸取一定体积的溶液，加入到培养基中。
调pH：一般用pH试纸测定培养基的pH。用剪刀剪取一小段pH试纸，然后用镊子夹住pH试纸，在培养基中蘸一下，观看其pH范围，如培养基偏酸或偏碱时，可用1mol/L NaOH或1mol/L HCl溶液进行调节。调节pH时，应逐滴加入NaOH或HCl溶液，防止局部过酸或过碱，破坏培养基中成分。边加边搅拌，并不时用pH试纸测试，直至达到所需pH为止。
棉花 纸条，宽5cm 移液管 20
过滤：用滤纸或多层纱布过滤培养基。一般无特殊要求时，此步可省去。 2）固体培养基的配制
配制固体培养基时，应将已配好的液体培养基加热煮沸，再将称好的琼脂(1.5％～2％)加入，并用玻棒不断搅拌，以免糊底烧焦。继续加热至琼脂全部融化，最后补足因蒸发而失去的水分。
4. 培养基的分装
根据不同需要，可将已配好培养基装入试管或锥形瓶内，分装时注意不要使培养基沾污管口或瓶口，造成污染。如操作不小心，培养基沾污管口或瓶口时，可用镊子夹一小块脱脂棉或卷纸，擦去管口或瓶口的培养基。 1）试管的分装
取一个玻璃漏斗，装在铁架上，漏斗下连一根橡皮管，橡皮管下端再与另一玻璃管相接，橡皮管的中部加一弹簧夹。分装时，用左手拿住空试管中部，并将漏斗下的玻璃管嘴插入试管内，以右手拇指及食指开放弹簧夹，中指及无名指夹住玻璃管嘴，使培养基直接流入试管内(图3－2)。
图3－2 培养基的分装
装入试管培养基的量视试管大小及需要而定，若所用试管大小为15×150 mm时，液体培养基可分装至试管高度l/4左右为宜；如分装固体或半固体培养基时，在琼脂完全融化后，应趁热分装于试管中；用于制作斜面的固体培养基的分装量为管高1/3(约10 m1)；半固体培养基分装量为管高的1/3为宜。
2）锥形瓶的分装
用于振荡培养微生物用时，可在250m1锥形瓶中加入50m1的液体培养基；若用于制作
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平板培养基用时，可在250ml锥形瓶中加入150m1液体培养基，然后再加入3g琼脂粉(按2％计算)，灭菌时瓶中琼脂粉同时被融化。
5. 棉塞的制作及试管、锥形瓶的包扎
为了培养好气性微生物，需提供优良通气条件，同时为防止杂菌污染，则必须对通入试管或锥形瓶内空气预先进行过滤除菌。通常方法是在试管及锥形瓶口加上棉花塞等。
1）试管棉塞的制作
制棉塞时，应选用大小、厚薄适中的普通棉花一块，铺展于左手拇指和食指扣成的圆孔上，用右手食指将棉花从中央压入圆孔中制成棉塞，然后直接压入试管或锥形瓶口。也可借用玻璃棒塞入，也可用折迭卷塞法制作棉塞(图3－3)。
铺平 折角 卷 成形 图3－3 棉塞制作过程
制作的棉塞应紧贴管壁，不留缝隙，以防外界微生物沿缝隙侵入，棉塞不宜过紧或过松，塞好后以手提棉塞，试管不下落为准。棉塞的2/3在试管内，1/3在试管外(图3－4)。目前也有采用金属或塑料试管帽代替棉塞，直接盖在试管口上，灭菌待用。将装好培养基并塞好棉塞或盖好管帽的试管捆成一捆，外面包上一层牛皮纸。用铅笔注明培养基名称及配制日期。灭菌待用。
2）锥形瓶棉塞制作
通常在棉塞外包上一层纱布，再塞在瓶口上。有时为了进行液体振荡培养加大通气量，则可用8层纱布代替棉塞包在瓶口上。目前也有采用无菌培养容器封口膜直接盖在瓶口上，既保证良好通气，过滤除菌又操作简便，故极受欢迎。
在装好培养基并塞好棉塞或包上八层纱布或盖好培养容器封口膜的锥形瓶口上，再包上一层牛皮纸并用线绳捆好，灭菌待用。
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图3－4 试管帽和棉塞
1.试管帽；2.正确的棉塞；3.不正确的棉塞；4.不正确的棉塞
6. 培养基的灭菌
培养基经分装包扎之后，应立即进行高压蒸汽灭菌，121℃灭菌20 min。如因特殊情况不能及时灭菌，则应暂存于冰箱中。 7. 斜面和平板的制作
1）斜面的制作
将已灭菌装有固体培养基的试管，趁热置于木棒上，使成适当斜度，凝固后即成斜面(图3－5)。斜面长度为试管长度1/3，底层长为试管的2/3。如制作半固体或固体深层培养基时，灭菌后则应垂直放置至冷凝。
2）平板的制作
将装在锥形瓶或试管中已灭菌的固体培养基融化后，待冷至50℃左右倾入无菌培养皿中。倒平板时，培养基温度过高，皿盖上的冷凝水太多；温度低于50℃，培养基易于凝固而无法制作平板。
平板的制作应在火旁进行，左手拿培养皿，右手拿锥形瓶的底部或试管，左手同时用小指和手掌将棉塞打开，灼烧瓶口，用左手大拇指将培养皿盖打开一缝，至瓶口正好伸入，倾入10～12 m1的培养基，迅速盖好
皿盖，置于桌上，轻轻旋转平皿，使培养基均匀分布于整个平皿中，冷凝后即成平板(图3－6)。
8. 培养基的无菌检查
灭菌后的培养基，一般需进行无菌检查。最好从中取出1～2管(瓶)，置于37℃温箱中培养1～2d，确定无菌后方可使用。
9. 无菌水的制备
在每个250 m1的锥形瓶内装99 m1的蒸馏水并塞上棉塞。在每支试管内装4.5 m1蒸馏水。塞上棉塞或盖上塑料试管盖。再在棉塞上包上一张牛皮纸。高压蒸汽灭菌，121℃灭菌20 min。
（五）实验报告内容
1. 简述移液管包装注意事项。 2. 简述配制液体培养基的简单步骤。 3. 简述斜面及平板培养基的制作过程。
图3－6 平板的制作 图3－5 斜面的制作 23
（六）思考题
1. 为什么微生物实验室所用的移液管口或滴管口的上端均需塞上一小段棉花，再用报纸包起来，经高压蒸汽灭菌后才能使用？
2. 为什么微生物实验室所用的锥形瓶口或试管口都要塞上棉塞，经高压蒸汽灭菌后才能使用？制作合格棉塞的标准是什么？ 3. 配制培养基时为什么要调节pH?
4. 配制固体培养基时，需在液体培养基中添加多少量的琼脂？ 5. 将含琼脂的培养基分装至试管中应如何操作？注意事项是什么? 6. 制作斜面培养基时，其斜面长度应相当于试管长度几分之几为宜？ 7. 制作平板培养基的注意事项是什么？
8. 培养基配好后，为什么必须马上进行高压蒸汽灭菌?如不能及时灭菌时，应将培养基暂时放置何处？
9. 如何检查灭菌后的培养基是否无菌？
二、细菌、放线菌常用培养基的配制
(一)目的要求
了解半合成和合成培养基的配制原理。
学习和掌握牛膏蛋白胨培养基、LB培养基和高氏合成Ⅰ号培养基的配制方法。 （二）基本原理
牛肉膏蛋白胨培养基是一种广泛用于培养细菌的培养基。而LB培养基则是一种近年来用于培养基因工程受体菌(大肠杆菌)的常用培养基。两者都属于半合成培养基。牛肉膏蛋白胨培养基的主要成分是牛肉膏、蛋白胨和NaCl。而LB培养基的主要成分是胰化蛋白胨、酵母提取物和NaCl。它们分别提供微生物生长繁殖所需要的碳源、氮源、能源、生长因子和无机盐等。培养基都是水溶液，这是因为一切生物细胞都必须要水，蒸馏水不含杂质，比自来水好，特别是配制合成培养基时都必须用蒸馏水，配天然培养基时可用自来水，但自来水中常含Ca，Mg离子，易与其它成分形成沉淀。
高氏合成Ⅰ号培养基是一种用于培养放线菌的合成培养基。培养基中的可溶性淀粉作为碳源和能源，KNO3作为氮源，K2HPO4、MgSO4和Fe2SO4为无机盐等。
（三）实验材料 1. 药品
牛肉膏、蛋白胨、NaCl、胰蛋白胨(bacto-tryptone)、酵母提取物(bacto-yeast extract)、可溶性淀粉、KNO3、K2HPO4、Mg2SO4·7H2O、Fe2SO4·7H2O、琼脂等。 2. 溶液
1mol/L NaOH、1mol/L HCl、0.1％Fe2SO4·7H 2O。 3. 仪器
天平、高压蒸汽灭菌锅。
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2+
2+
4. 玻璃器皿
移液管、试管、烧杯、量筒、锥形瓶、培养皿、玻璃漏斗等。 5. 其它物品
药匙、pH试纸、称量纸、记号笔、棉花、纱布、线绳、塑料试管盖、牛皮纸、报纸等。
（四）实验步骤
1. 肉膏蛋白胨培养基的配制
1）培养基成分
牛肉膏0.5g，蛋白胨1g，NaCl 0.5g，琼脂1.5～2g，水100 ml，pH 7.2。 2）配制方法
称量及溶化：分别称取蛋白胨和NaCl的所需量，置于烧杯中，加入所需水量2/3左右的蒸馏水；用玻棒挑取牛肉膏置于另一小烧杯中，进行称量，然后加入少量蒸馏水，加热溶化，倒入上述烧杯中。将烧杯置于石棉网上加热，用玻棒搅拌，使药品全部溶化。 调pH：待溶液冷至室温时，用1mol/L NaOH溶液调pH至7.2。 定容：将溶液倒入量筒中，补充水量至所需体积。 加琼脂：加入所需量的琼脂，加热融化，补充失水。 分装、加塞、包扎。
高压蒸汽灭菌：121℃灭菌20 min。
2. 高氏合成Ⅰ号培养基的配制 1）培养基成分
可溶性淀粉2g，KNO3 0.1g，K2HPO4·3H2O 0.05g，NaCl 0.05g， MgSO4·7H2O 0.05g，Fe2SO4·7H2O 0.001g，琼脂1.5～2g，蒸馏水100 ml，pH7.2～7.4。
2）配制方法
称量及溶化：量取所需水量的2／3左右加入到烧杯中，置于石棉网上加热至沸。称量可溶性淀粉，置于另一小烧杯中，加入少量冷水，将淀粉调成糊状，然后倒入上述装沸水的烧杯中，继续加热，使淀粉完全溶化。
分别称量KNO3、NaCl、K2HPO4和MgSO4，依次逐一加入水中溶解。按每100 m1培养基加入0.1％Fe2SO4溶液1ml。
调pH：用1mol/L NaOH溶液调pH至7.4。 定容：将溶液倒入量筒中，加水至所需体积。
加琼脂：加入所需重量的琼脂，加热融化，补充失水。 分装、加塞、包扎。
高压蒸汽灭菌：121℃灭菌20 min。
（五）实验报告内容
1. 记录你所配制培养基的名称及成分。
2. 分析你所配制培养基的碳源、氮源、能源、无机盐及维生素的来源。
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（六）思考题
1. 培养细菌一般常用什么培养基? 2. 培养放线菌常用什么培养基? 3. 何谓半合成培养基?何谓合成培养基? 4. 牛肉膏应置于何种容器中称量为宜?
5. 配制高氏合成Ⅰ号培养基时，可溶性淀粉需经什么处理后才能倒入到沸水中?
三、酵母菌、霉菌常用培养基的配制
（一）目的要求
了解合成培养基、半合成培养基和天然培养基的配制原理。
学习和掌握麦芽汁培养基、马铃薯葡萄糖培养基、豆芽汁葡萄糖培养基和察氏培养基的配制方法。
（二）基本原理
麦芽汁培养基和马铃薯葡萄糖培养基被广泛用于培养酵母菌和霉菌。马铃薯葡萄糖培养基有时也可用于培养放线菌。豆芽汁葡萄糖培养基也是培养酵母菌及霉菌的一种优良培养。
察氏培养基主要用于培养霉菌进行形态观察。麦芽汁培养基为天然培养基，马铃薯葡萄糖培养基和豆芽汁葡萄糖培养基二者均为半合成培养基，而察氏培养基则为合成培养基。培养基配方中出现的自然pH系指培养基不经酸、碱调节而自然呈现的pH。
（三）实验材料 1. 药品
葡萄糖、蔗糖、NaNO3、K2HPO4、KCl、Mg2SO4·7H2O、Fe2SO4、琼脂。 2. 仪器
天平、高压蒸汽灭菌锅。 3. 玻璃器皿
移液管、试管、锥形瓶、烧杯、量筒、培养皿、玻璃漏斗等。 4. 其它物品
药匙、pH试纸、称量纸、记号笔、棉花、纱布、线绳、塑料试管盖、牛皮纸、报纸、
新鲜麦芽汁、黄豆芽、马铃薯等。
（四）实验步骤
1. 马铃薯葡萄糖培养基的配制 1）培养基成分
马铃薯20 g，葡萄糖2g，琼脂1.5～2g，水100 m1，自然pH。 2）配制方法
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配制20％马铃薯浸汁：取去皮马铃薯200g，切成小块，加水1000m1。100℃煮沸半小时，用纱布过滤，然后补足失水至所需体积。121℃灭菌20 min。即成20％马铃薯浸汁，存备用。
配制：按每100ml马铃薯浸汁加入2g葡萄糖，加热煮沸后加入2g琼脂，继续加热融化，并补足失水。
分装、加塞、包扎。
高压蒸汽灭菌：121℃灭菌20 min。
2. 豆芽汁葡萄糖培养基的配制 1）培养基成分
黄豆芽10g，葡萄糖5g，琼脂1.5～2g，水100 ml，自然pH。 2）配制方法
称量熔化：称新鲜黄豆芽10 g，置于烧杯中，再加入l00ml水，小火煮沸30 min，用纱布过滤，补足失水，即制成l0％豆芽汁。
配制：按每100ml 10％豆芽汁加入5g葡萄糖，煮沸后加入2g琼脂，继续加热融化，补足失水。
分装、加塞、包扎。
高压蒸汽灭菌：121℃灭菌20 min。
（五）实验报告内容
记录你所配制培养基的名称及成分。 （六）思考题
1. 马铃薯葡萄糖培养基和豆芽汁葡萄糖培养基常用于培养哪类微生物？ 2. 何谓培养基的自然pH？
四、高压蒸汽灭菌
（一）目的要求 了解高压蒸汽灭菌原理。
学习并掌握高压蒸汽灭菌的操作。
（二）基本原理
高压蒸汽灭菌是微生物学实验、发酵工业生产、以及外科手术器械等方面最常用的一种灭菌方法。一般培养基、玻璃器皿、无菌水、无菌缓冲液、金属用具、接种室的实验服及传染性标本等都可采用此法灭菌。
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安全阀 温度计 压力表 放气阀 蒸汽入口 安全阀 排气口 压力表 安全阀 水位显示 排气口 排水口 图3－7 高压蒸汽灭菌锅结构
高压蒸汽灭菌器是一个能耐高压、同时可以密闭的金属锅，有立式、卧式、手提式三种（图3－7）。热源可以用蒸汽、煤气或电源。灭菌器上装有表示锅内温度和压力的温度计、压力表。灭菌锅还有排气口、安全活塞，如果压力超过一定限度，活塞的阀门便自动打开，放出过多的蒸汽。
高压蒸汽灭菌是把待灭菌物品放在一个密闭的高压蒸汽灭菌锅中，当锅内压力为0.1MPa时，温度可达到121℃，一般维持20 min即可杀死一切微生物的营养体及其孢子。高压蒸汽灭菌是依据水的沸点随水蒸汽压的增加而上升，加压是为了提高水蒸汽的温度。蒸汽压力与蒸汽温度关系及常用灭菌时间见表3－1
表3－1 高压蒸汽灭菌时常用的灭菌压力、温度与时间 蒸 汽 压 力*
Pa 56 70 100
kg/cm 0.56 0.70 1.00
2
蒸汽温度
b/in 8.00 10.00 15.00
2
灭菌时间(min)
(℃) 112.6 115.2 121.0
30 20 20
28
*1 kg/cm2(1千克/厘米2)≈105 Pa，1b/in2（1磅/寸2）≈6894.76 Pa，将几种单位列于同一表内以便于换算。
表3－2 空气排除程度与温度关系
压力表读数/Pa 35 70 105 140 175 210
高压蒸汽灭菌技术关键是在压力上升之前需将锅内冷空气排尽。若锅内未排除的冷空气滞留在锅中，压力表虽指121℃，但锅内温度实际上只有100℃（空气排除程度与温度关系见表3－2），结果造成灭菌不彻底。
待灭菌物品中的微生物种类、数量与灭菌效果直接相关。一般在小试管、锥形瓶中小容量的培养基，用121℃灭菌20min，大容量的固体培养基传热量慢，灭菌时间适当延长（灭菌时间是指达到所要求的温度开始计算）。天然培养基含菌和芽孢较多，较合成培养基灭菌时间略长。
灭菌时的过高温度常对培养基造成不良影响。如：
（1）出现浑浊、沉淀（天然培养基成分加热沉淀出大分子多肽聚合物；培养基中Ca、Mg、Fe、Zn、Cu、Sb等阳性离子与培养基中可溶性磷酸盐共热沉淀。）
（2）营养成分破坏或改变（酸度较高时淀粉、蔗糖、乳糖或琼脂灭菌过程易水解；pH7.5、121℃灭菌20 min，葡萄糖破坏20%，麦芽糖破坏50%，若培养基中磷酸盐共存，葡萄糖转变成酮糖类物质，培养液由淡黄色变为红褐色，破坏更为严重。
（3）pH7.2时培养基中的葡萄糖、蛋白胨、磷酸盐在121℃灭菌15 min以上可产生对微生物生长的某种抑制物。
(4) 高压蒸汽灭菌后培养基pH下降0.2～0.3。
(5) 高压蒸汽灭菌过程会增加冷凝水，降低培养基成分浓度。
对于前三种不良影响，可采用低压灭菌(如在112℃、30 min灭菌葡萄糖溶液)，或将培养基几种成分分别灭菌，临用前无菌混合（如磷酸盐与Ca2+、Mg2+、Zn2+、Cu2+等阳性离子溶液）的方法，特殊情况时可采用间歇灭菌、过滤除菌（如维生素溶液）。工业发酵生产中常采用连续加压灭菌法(135～140℃、5～15s)和连续蒸煮法。
灭菌前配培养基时适当调整。
（三）实验材料 手提式高压蒸汽灭菌锅。
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未排除空气
排除1/3空气
灭菌器内温度/℃
排除1/2空气
排除2/3空气
完全排除空气
72 90 100 109 115 121
90 100 109 115 121 126
94 105 112 118 124 128
100 109 115 121 126 130
109 115 121 126 130 135
待灭菌的培养基、无菌水、已包好的培养皿、移液管、玻璃涂棒等及待灭菌空试管、锥形瓶等玻璃器皿。
（四）实验步骤 1. 灭菌操作
1）打开灭菌锅盖向锅内加水，向锅内加适量水(立式高压蒸汽灭菌锅从进水杯处加煮开过的水到量高水位的标示高度)。水量不足，灭菌锅易蒸干。
2）放入待灭菌物品
将待灭菌物品放入灭菌桶内，物品不要放得太紧和紧靠锅壁，以免影响蒸汽流通和冷凝水顺壁流入灭菌物品。
3）盖好锅盖
将盖上的软管插入灭菌桶的槽内，有利于罐内冷空气自下而上排出，加盖，上下螺栓口对齐，采用对角方式均匀旋紧螺栓，使锅密闭。
4）排放锅内冷空气及升温灭菌
打开放汽阀，加热(电加热或煤气加热或直接通入蒸汽)，自锅内开始产生蒸汽后3 min再关紧放汽阀(或喷出气体不形成水雾)，此时蒸汽已将锅内的冷空气由排气孔排尽，温度随蒸汽压力增高而上升，待压力逐渐上升至所需温度时，控制热源，维持所需压力和温度，并开始计时，一般培养基控制在121℃灭菌20 min；含糖等成分培养基控制在112℃灭菌30 min或115℃灭菌20 min，关闭热源，停止加热，压力随之逐渐降低。
5）灭菌完毕降温及后处理
待压力降至0时，慢慢打开放汽阀(排汽口)，开盖，立即取出灭菌物品。但在压力未完全降至0处前，不能打开锅盖，以免培养基沸腾将棉塞冲出；也不可用冷水冲淋灭菌锅迫使温度迅速下降。所灭物品开盖后立即取出，以免凝结在锅盖和器壁上的水滴弄湿包装纸或落到被灭菌物品上，增加染菌率。斜面培养基自锅内取出后要趁热摆成斜面，灭菌后的空培养皿、试管、移液管等需烘干或晾干。若连续使用灭菌锅，每次需补足水分；灭菌完毕，除去锅内剩余水分，保持灭菌锅干燥。
2. 无菌试验
可抽少数灭过菌的培养基置37℃恒温箱中培养24h，若无菌生长，即视为灭菌彻底，可保存备用。
高灭蒸汽灭菌注意事项：
灭菌时人不能离开工作现场，控制热源维持灭菌时的压力。压力过高，不仅培养基的营养成分被破坏，而且高压锅超过耐压范围易发生爆炸造成伤人事故。
（五）实验报告内容
说明高压蒸汽灭菌原理、适用范围。用简练方法表示操作过程及操作关键。
（六）思考题
1. 高压蒸汽灭菌的关键为什么是高温而不是高压？高压蒸汽灭菌前为什么要将灭菌
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锅内的冷空气排尽？灭菌时为什么人不能离开工作现场？灭菌完毕后什么情况下才可以打开锅盖取灭菌物品？
2. 染菌或接种有微生物的培养基或培养器皿为什么不能直接洗涤而需先经过高压蒸汽灭菌？培养皿或锥形瓶内含菌固体培养基灭菌后如何处理？
3. 对含糖(如含葡萄糖或乳糖等)培养基进行高压蒸汽灭菌时，应采用多大压力、多长时间灭菌为宜？
4. 对血清、噬菌体浓缩液、氨基酸溶液、维生素溶液、抗生素溶液能否进行高压蒸汽灭菌？应采用何种方法除菌为宜？
实验四 微生物的分离与纯化
纯种分离技术是微生物学中重要的基本技术之一。从混杂微生物群体中获得单一菌株纯培养的方法称为分离。纯种(纯培养)是指一株菌种或一个培养物中所有的细胞或孢子都是由一个细胞分裂、繁殖而产生的后代。
为了生产和科研的需要，人们往往需从自然界混杂的微生物群体中分离出具有特殊功能的纯种微生物；或重新分离被其它微生物污染或因自发突变而丧失原有优良性状的菌株；或通过诱变及遗传改造后选出优良性状的突变株及重组菌株。尽管所分离、纯化的菌种不同，但分离、筛选及纯化新菌种的步骤都基本相似。大致分为采样、富集培养、纯种分离和性能测定四个步骤。
采样：主要依据所筛选的微生物生态及分布概况，综合分析决定采样地点。
富集培养：根据所筛选菌种的生理特性，加入某些特定物质，使所需的微生物增殖，造成数量上的优势，限制不需要的微生物生长繁殖。对无特殊性能要求的菌，可省略此步。
纯种分离：可用10倍稀释平板分离法、涂布法、划线分离法、单细胞分离法等。 性能测定：可分初筛和复筛两步。
本章主要介绍细菌、放线菌、酵母菌、霉菌常见四大类微生物分离、纯化方法。 即使采用最现代的分离技术，人类生产和生活中现已开发利用的微生物尚未超过其存在量的1％。寻找和发现有重要应用潜力、具有新功能的微生物菌种资源，尚有待于不断提出新思路、新的筛选与分离方法的突破。
一、微生物的接种技术
（一）目的要求
了解无菌操作在微生物接种过程中的重要性。 掌握几种常用的微生物接种方法。
（二）基本原理
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微生物的接种技术是生物科学研究中的一项最基本的操作技术。由于目的不同，可采用不同的接种方法，如斜面接种、穿刺接种或三点接种等，以获得生长良好的纯种微生物。选择一种好的接种方法，对于微生物的分离、纯化、增殖和鉴别等都很重要。因接种方法的不同，常需采用不同的接种工具，如接种环、接种针、移液管和涂布棒等，它们的外形见图4－1。
为了确保纯种不被杂菌污染，在整个接种过程中，必须进行严格的无菌操作。 本实验就一些常规的微生物接种方法作一扼要介绍。
（三）实验材料 1. 菌种：
金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）；大肠杆菌（Escherichia coli）；黑曲霉（Aspergillus niger）等。
2. 培养基：
肉汤蛋白胨斜面4支，肉汤蛋白胨培养液2支（或装三角烧瓶），半固体肉汤蛋白胨直立柱4支，马铃薯葡萄糖琼脂平板6只（配方见附表二）。
3. 接种工具：
接种环、接种针、移液管、滴管、涂布棒。 4.其它：
标签纸、打火机、酒精灯（或煤气灯）、镊子、橡皮滴头等。
（四）实验步骤
1. 斜面接种：斜面接种是从已生长好的菌种斜面上挑取少量菌种把它移接到另一支新鲜斜面培养基上的一种接种方法。具体操作如下：
（1）贴标签：接种前在试管上贴上标签，注明菌名、接种日期等。标签纸要贴在斜面的正上方，距试管口约2～3厘米的位置。
（2）点酒精灯（或煤气灯）：注意火焰不要过大，以免气流运动过速。
（3）接种：用接种环将大肠杆菌移接到贴好标签的试管斜面上。无菌操作程序见图4－2，现简述如下：
手持试管：在左手的食指、中指和无名指间分别夹上菌种和待接斜面（斜面向上），并斜放使之近水平状态。
旋松棉塞：先用右手将棉塞旋松，以便拔出。
取接种环：右手拿接种环（如握钢笔一样），在火焰上先将环端烧红灭菌，然后将有可能伸入试管的其余部位也过火灭菌。
拔棉塞：用右手的无名指、小指和手掌边先后拔出菌种管和待接试管的棉花塞（或试管帽），然后让试管口缓缓过火灭菌（切勿烧得过烫）。
冷却接种环：将灼烧过的接种环伸入菌种管，先使环接触菌种管的培养基（如斜面顶端）部分，使环冷却。
取菌种：待环冷却后轻轻沾取少量菌苔或孢子，然后将接种环移出菌种管。
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图附4－1 接种工具
1.接种针；2.接种环；3.接种铲；4.移液管；5.滴管；6－7.玻璃涂棒
图附4－2 斜面接种无菌操作程序
1.烧环；2.拔塞；3.移种；4.加塞；5.灭菌
接种：在火焰旁将沾有菌种的接种环伸入另一支待接斜面试管。从斜面培养基的底部向上作“Z”形来回密集划线。若要将菌体接入液体培养基中，则待接试管要适当向上倾斜。
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洗脱环上菌体时，要使环和容器壁摩擦几下以利洗下环上菌体，接种好后还要适当摇动以使菌体分散均匀。有时也可用接种针仅在斜面培养基的中央拉一条线来作斜面接种，以便观察菌种的生长特点。
塞棉塞：接好种的试管口再次过火，并塞上棉花塞。
环灭菌：将接种环烧红灭菌。放下接种环，再将棉花塞旋紧。
（4）培养：将接过种的斜面放在37 ℃（细菌）或28 ℃（真菌和放线菌）恒温箱中培养。24小时后观察斜面生长结果。
2. 穿刺接种
经穿刺接种后的菌种常作为保藏菌种的一种形式，同时也是检查细菌运动能力的一种方法，它只适宜于细菌和酵母的接种培养。穿刺接种是一中用接种针从菌种斜面上挑取少量菌体并把它穿刺到固体或半固体肉汤蛋白胨直立柱中的一种接种方法。具体操作如下：
（1）贴标签。 （2）点酒精灯。
（3）穿刺接种：穿刺接种方法见图4－3，操作要点说明如下： a手持试管。 b旋松棉塞。
c取接种针：右手拿接种针在火焰上将针端烧红灭菌。接着把在穿刺中可能伸入试管的其它部位，也过火灭菌。
d拔塞取菌：用右手的小指和手掌边拔出棉塞。接种针先在培养基部分冷却，再用接种针的针尖沾取少量菌种（蜡样芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌）。
e接种：将接种针自培养基的中心垂直地刺入培养基中。穿刺时要做到手
稳、动作轻巧快速，并且要将接种针穿刺到试管的底部，然后沿着原接种线将针拔出。最后，塞上棉塞，再将接种针上残留的菌在火焰上烧掉。
（4）培养：将接种过的试管直立于试管架上，放在37℃（细菌）或28℃（酵母菌）恒温箱中培养，24小时后观察结果。
（注意：若具有运动能力的细菌，它能沿着接种线向外运动而弥散，故形成的穿刺线较粗而散，反之则细而密）
3. 三点接种
要获得霉菌的单菌落，宜在平板上用三点接种法接种。即用接种针沾取少量霉菌孢子，在琼脂平板上点接成等边三角形的三点。经培养后，每皿形成三个菌落。其优点不但在一个培养皿上同种菌落有三个重复，更重要的是在菌落彼此相接近的边缘，常留有一条狭空白地带，此处菌丝生长疏稀，较透明，气生菌丝还分化出稀落的子实器官，因此可以直接把培养
图4－3 穿刺接种示意图
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皿放在低倍镜下观察子实体的形态特征，便于根据形态特点进行菌种的鉴定。这是单点接种法所难以做到的。
（1）倒平板：将已灭菌的马铃薯琼脂培养基放在水浴锅中充分加热融化，待冷却至45℃左右（手握不觉得太烫为宜）后，用无菌操作法倒平板，具体操作见图2－5（8）。
（2）贴标签：待平板凝固后，在培养皿底部贴上标签（也可用记号笔写），注明菌名、日期等。
（3）三点接种：用接种针从菌种斜面上分别挑取少量菌种孢子（产黄青霉、黑曲霉等），点接到对应的平板上。一般以三点（∴）的形式接种。操作要点为：
标明三点位置：欲使点接的三点分布均匀，可用记号笔先在平板底部以等边三角形状标上三点。
取接种针：拿接种针，先在火焰上烧红灭菌，并在平板培养基的边缘冷却且蘸湿。 沾取孢子：将灭过菌并蘸湿的接种针伸入菌种管，用针尖沾取少量霉菌孢子。
点接：将接种针上沾着的孢子以垂直的方向轻轻地点接平板培养基表面预先作好标记的部位。注意在点接时切勿刺破培养基。
(4) 培养：将点接好的平板倒置于28℃恒温箱中培养。48小时后开始观察生长情况。
4. 液体菌种接种技术
液体菌种接种技术是一种用移液管、滴管或接种环等将菌液移接到液体三角烧瓶、试管或固体培养基中的一种接种方法。具体操作如下：
（1）移液管的包装灭菌：移液管单支包装法可见图3－1，也可将它们放入铜质或玻璃筒内灭菌。
（2）取移液管：取用单支纸包装的移液管时，可将移液管打有纸结一端的包装纸拧断，露出移液管的末端，取出移液管。
（3）移菌液：用无菌操作吸取所需的菌液，移菌液操作见图4－5（3）所示。 （4）接种：
取待接培养液：左手拿待接种的三角烧瓶培养液（注意勿使瓶口朝天），并用右手的小指和手掌边拔出棉花塞或纱布通气塞，瓶口缓缓旋转过火。
接种：将移液管伸入三角瓶内，慢慢放出菌液至所需的接种量，或将菌液全部吹入三角瓶培养液中，塞上棉塞。在液体菌种中，经常采用倒种方法，即将菌液试管中的菌种倒入待接三角烧瓶培养液中。
（5）移液管灭菌：将用过的移液管投入5％石炭酸缸内灭菌。
（6）扎口：如使用通气塞，则还应将塞子拉好，用棉纱绳以活结形式将通气塞扎牢。 （7）培养：将接种过的三角烧瓶置于恒温箱内或摇床上恒温培养，24小时后观察生长结果。
图4－4 三点接种形成的青霉菌落
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图4－４ 斜面接种后生长的菌苔类型
（五）实验报告内容
1. 检查你的斜面接种情况，绘制斜面生长草图，并说明是属于下列哪一类。 2. 分析你的斜面接种好坏的原因。
3. 检查你的穿刺接种结果，并绘制结果草图。 4. 分析穿刺接种好坏的原因。
5. 检查三点接种生长情况，描述每一菌种的菌落特征。
（六）思考题
1. 接种时，为什么要严格地按照无菌操作程序进行。 2. 斜面接种时，标签要贴在斜面的什么位置，为什么？ 3. 穿刺接种时应注意什么？
4. 三点接种时为什么不要刺破培养基。
二、土壤中细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的分离与纯化
（一）目的要求
学习、掌握细菌、放线菌、酵母菌和霉菌稀释分离、划线分离等技术。 学习从样品中分离、纯化出所需菌株。
学习并掌握平板倾注法和斜面接种技术，了解培养细菌、放线菌、酵母菌及霉菌四大类微生物的培养条件和培养时间。
学习平板菌落计数法。
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（二）基本原理
土壤是微生物生活的大本营，是寻找和发现有重要应用潜力的微生物的主要菌源。不同土样中各类微生物数量不同，一般土壤中细菌数量最多；其次为放线菌和霉菌。一般在较干燥、偏碱性、有机质丰富的土壤中放线菌数量较多；酵母菌在一般土壤中的数量较少，而在水果表皮、葡萄园、果园土中数量多些。本次实验从土壤中分离细菌、放线菌和霉菌；自面肥或酒曲或果园土分离酵母菌。
为了分离和确保获得某种微生物的单菌落，首先要考虑制备不同稀释度的菌悬液。各类菌稀释度因菌源、采集样品时的季节、气温等条件而异。其次，应考虑各类微生物的不同特性；避免菌源中各类微生物的相互干扰。细菌或放线菌皆喜中性或微碱性环境，但细菌比放线菌生长快，分离放线菌时，一般在制备土壤稀释液时添加l0％的酚或在分离培养基中加相应的抗生素以抑制细菌和霉菌(如加链霉素25～50u/m1以抑制细菌；添加制霉菌素50u /m1或多菌灵30u／m1以抑制霉菌)。酵母菌和霉菌都喜酸性环境，一般酵母菌只能以糖为碳源，不能直接利用淀粉，酵母菌在pH 5时生长极快，而细菌生长适宜的酸碱度为pH7，所以分离酵母菌时，只要选择好适宜的培养基和pH，可降低细菌增殖率。霉菌生长慢，也不干扰酵母菌分离。若分离霉菌，需降低细菌增殖率，一般培养基临用前需添加灭过菌的乳酸或链霉素。为了防止菌丝蔓延干扰菌落计数，分离霉菌时常在培养基中加入化学抑制剂。要想获得某种微生物的纯培养，还需提供有利于该微生物生长繁殖的最适培养基及培养条件。微生物四大类菌的分离培养基、培养温度、培养时间见表4－l所示。
（三）实验材料
1. 菌源：选定采土地点后，铲去表土层2～3cm，取3～10cm深层土壤10g，装入已灭过菌的牛皮纸袋内，封好袋口，并记录取样地点、环境及日期。土样采集后应及时分离，凡不能立即分离的样品，应保存在低温、干燥条件下，尽量减少其中菌相的变化。
表4－1 微生物四大类菌的分离和培养 样品来源 土样 土样 土样 面肥(或土样) 细菌分离平板 分离对象 细菌 放线菌 霉菌 酵母菌 细菌 分离方法 稀释分离 稀释分离 稀释分离 稀释分离 划线分离 稀释度 10－5～10－7 10－3～10－5 10－2～10－4 10－4～10－6 培养基名称 肉膏蛋白胨 高氏合成1号 马铃薯 豆芽汁葡萄糖 肉膏蛋白胨 培养温度℃ 30～37 28 28～30 30～37 28～30 时间／d 1～2 5～7 3～5 1～2 2～3
2. 培养基
肉膏蛋白胨培养基、高氏合成l号培养基、马铃薯培养基、豆芽汁葡萄糖培养基(制平板和斜面)。配方见附录二。
3. 无菌水或无菌生理盐水
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配制生理盐水，分装于250 m1锥形瓶，每瓶装99 ml(或95 m1为分离霉菌用)，每瓶内装10粒玻璃珠。分装试管、每管装9 m1(每人5～7支)。
4. 其它物品
无菌培养皿、无菌移液管、无菌玻璃涂棒(刮刀)、称量纸、药勺、橡皮头、10％酚溶液。
（四）实验步骤 1. 稀释分离法
平板分离菌有倾注法和涂布法两种。本次实验分离细菌、放线菌、霉菌时采用倾注法，酵母菌分离采用涂布法。
1）细菌的分离
制备土壤稀释液：称取土样1g，在火焰旁加入到一个盛有99 m1无菌水或无菌生理盐水并装有玻璃珠的锥形瓶中，振荡10～20 min，使土样中菌体、芽孢或孢子均匀分散，制成10－2稀释度的土壤稀释液。
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按10倍稀释法进行稀释分离，以制备10－7稀释度为例，具体操作过程如下：取9 ml
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无菌水试管6支，按10－3～10－7顺序编号，放置试管架上。取无菌移液管一支，从移液管包装纸套中间撕口，将包装纸套分成上、下两段，去除上段包装纸套，在移液管上端管口装橡皮头，取出下段移液管纸套放置桌面；以右手拇指、食指、中指拿住移液管上端的橡皮头，将吸液端口及移液管外部表面迅速通过火焰2～3次，杀灭撕纸套时可能污染的杂菌，切忌不要用手指去触摸移液管吸液端口及外部。左手持锥形瓶底，以右手掌及小指、无名指夹住锥形瓶上棉塞，在火焰旁拔出棉塞(棉塞夹在手上，不能乱放在桌上)，将1m1移液管的吸液
端伸进振荡混匀的锥形瓶土壤悬液底部，用手指轻按橡皮头，在锥形瓶内反复吹吸三次（吹吸时注意第二次液面要高于第一次吹吸的液面），然后准确吸取1 m1 10－2土壤稀释液，右手将棉塞插回锥形瓶上，左手放下锥形瓶，换持一支盛有9 ml无菌水试管，依前法在火焰旁拔除试管帽(或棉塞)，将1 m1 10
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土壤稀释液注入9 m1无菌水试管内，制成10
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的土壤稀
释液，将此移液管在试管内反复吹吸三次，然后取出移液管，并将其通过火焰再插入原来包装移液管的下段纸套内，以备再用。盖上试管帽，右手持l0－3稀释液试管在左手上敲打20～30次，混匀土壤稀释液。再从纸套取出原来的移液管，插入稀释液已混匀的试管内，再吹吸三次，然后准确吸出1 m1 10－3的稀释液，置第二支装有9 ml无菌水试管中，制成10－4土壤稀释液。用同法再制成10、10、10
－5
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的土壤稀释液(为避免稀释过程产生误差，进
行微生物计数时，最好做每一个稀释度更换一支移液管)。最后用毕的移液管重新放入纸套内。待灭菌后，再洗刷或将用过的移液管放在废弃物筒中，用3％～5％来苏尔水浸泡1h后再灭菌洗涤。
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图4－5 稀释分离无菌操作示意图
1.从包装纸套中取出无菌移液管；2.安装橡皮头，勿用手指触摸移液管； 3.火焰旁取出土壤悬浮液；4.灼烧试管口及移液管吸液口；5.在火焰旁对试管中土壤悬浮液进行稀释；6.用手掌敲打试管，混匀土壤稀释液；7.从最小稀释度开始，将稀释液加入无菌培养皿中；8.将融化冷凉至45～50℃培养基倒入培养皿内；9.用毕的移液管装入废弃物缸中浸泡消毒后灭菌洗涤。
倾注法分离：取无菌培养皿6～9个，分别于培养皿底面按稀释度编号。稀释完毕后，可用原来的移液管从菌液浓度最小的10方法分别吸取1m1 10、10
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土壤稀释液开始吸取1ml稀释液，按无菌操作技
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术加到相应编号10－7的无菌培养皿内。再以相同
的土壤稀释液，各加到相应编号为10、10
的无菌培养皿
内。将己灭菌的肉膏蛋白胨固体培养基融化，待冷却至45～50℃左右，分别倾入到已盛有10－5、10－6、10－7土壤稀释液的无菌培养皿内。注意：温度过高易将菌烫死，皿盖上冷凝水太多，也会影响分离效果；低于45℃培养基易凝固，平板易出现凝块、高低不平。倾倒培养基时注意无菌操作，要在火焰旁进行。左手拿培养皿，右手拿锥形瓶底部，左手同时用小指和手掌将棉塞拨开，灼烧瓶口，用左手大拇指将培养皿盖打开一缝，至瓶口正好伸入，倾入培养基约12～15m1，将培养皿在桌面上轻轻前后左右转动，使稀释的菌悬液与融化的琼脂培养基混合均匀，混匀后静置桌上。整个操作过程见图4－5，4－6。
培养：待平板完全冷凝后，将平板倒置于30℃恒温箱中，培养24～48h后，观察结果。 2）放线菌的分离
制备土壤稀释液：称取土样l g，加入到一个盛有99 ml无菌水或无菌生理盐水并装有玻璃珠的锥形瓶中，并加入10滴l0％的酚溶液(抑制细菌生长)，有时也可不加酚。振荡后静置5min，即成10
～2
土壤稀释液。
倾注法分离：按前法将土壤稀释液分别稀释为10－3、10－4、10－5三个稀释度，然后用无菌移液管依次分别吸取1m1 10－5、10－4、10－3土壤稀释液于相应编号的无菌培养皿内，用高氏合成1号培养基依前法倾倒平板，每个稀释度做2～3个平行皿。
培养：冷凝后，将平板倒置于28℃恒温箱中，培养5～7d后观察结果。
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图4－6 稀释分离过程示意图
3）霉菌的分离
制备土壤稀释液：称取土样5g，加入到一个盛有95 m1无菌水或无菌生理盐水并装有玻璃珠的锥形瓶中，振荡10 min，即成10－2土壤稀释液。
倾注法分离：依前法将土壤稀释液再稀释成10－3、10－4的土壤稀释液。然后用无菌移液管分别吸取1m1 10－4、10－3、10－2土壤稀释液于相应编号的无菌培养皿内。采用马铃薯培养基倾倒平板，为了抑制细菌生长和降低菌丝蔓延速度，马铃薯培养基临用前需无菌加入孟加拉红、链霉素和去氧胆酸钠。每个稀释度作2～3平行皿。
培养：冷凝后，将平板倒置于28℃恒温箱中，培养3～5d后观察结果。 4）酵母菌的分离
制备菌悬液：称取面肥1g，加入到一个盛有99 ml无菌水或无菌生理盐水并装有玻璃珠的锥形瓶中，面肥发黏，用接种铲在锥形瓶内壁磨碎后移入无菌水或生理盐水内，振荡20 min，即成10释液。
涂布法分离：依前法向无菌培养皿中倾倒已融化并冷却至45～50℃的豆芽汁葡萄糖培养基，待平板冷凝后，用无菌移液管分别吸取上述10、10、10
－6
－5
－4
－2
的面肥稀释液。若选用果园土样，也依前法称取1g土样，制成10
－2
土壤稀
三个稀释度菌悬液0.1ml，
依次滴加于相应编号已制备好的豆芽汁葡萄糖培养基平板上，右手持无菌玻璃涂棒，左手拿
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培养皿，并用拇指将皿盖打开一缝，在火焰旁右手持玻璃涂棒于培养皿平板表面将菌液自平板中央均匀向四周涂布扩散，切忌用力过猛将菌液直接推向平板边缘或将培养基划破（图4－7）。
培养：待平板完全冷凝后，将平板倒置于30℃恒温箱中，培养2～3d后观察结果。
图4－7 涂布操作过程示意图
2. 划线分离法
菌种被其它杂菌污染时或混合菌悬液常用划线法进行纯种分离。此法是借助将蘸有混合菌悬液的接种环在平板表面多方向连续划线，使混杂的微生物细胞在平板表面分散，经培养得到分散成由单个微生物细胞繁殖而成的菌落，从而达到纯化目的。平板制作方法如前所述。但划线分离的培养基必须事先倾倒好，需充分冷凝待平板稍干后方可使用；为便于划线，一般培养基不宜太薄，每皿约倾倒20 ml培养基，培养基应厚薄均匀，平板表面光滑。划线分离主要有连续划线法和分区划线法两种。连续划线法是从平板边缘一点开始，连续作波浪式划线直到平板的另一端为止，当中不需灼烧接种针上的菌(图4－8A)；另一种是将平板分四区，故又称四分区划线法。划线时每次将平板转动60～70°划线(见图4－8B)，每换一次角度，应将接种针上的菌烧死后，再通过上次划线处划线。
A.连续划线法 B.分区划线法 图4－8 划线分离方式
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1）连续划线法
以无菌操作用接种环直接取平板上待分离纯化的菌落。将菌种点种在平板边缘一处，取出接种环，烧去多余菌体。将接种环再次通过稍打开皿盖的缝隙伸入平板，在平板边缘空白处接触一下使接种环冷凉，然后从接种有菌的部位在平板上自左向右轻轻划线，划线时平板面与接种环面成30～40°。以手腕力量在平板表面轻巧滑动划线，接种环不要嵌入培养基内划破培养基，线条要平行密集，充分利用平板表面积，注意勿使前后两条线重迭(图4－8A，4－9)。划线完毕，关上皿盖。灼烧接种环，待冷凉后放置接种架上。培养皿倒置于适温的恒温箱内培养(以免培养过程皿盖冷凝水滴下，冲散已分离的菌落)。培养后在划线平板上观察沿划线处长出的菌落形态，涂片镜检为纯种后再接种斜面。
图4－9 划线分离接种示意图
2）分区划线法(四分区划线法，图4－8B)
取菌、接种、培养方法与“连续划线法”相似。分区划线法划线分离时平板分4个区，故又称四分区划线法。其中第4区是单菌落的主要分布区，故其划线面积应最大。为防止第4区内划线与1、2、3区线条相接触，应使4区线条与1区线条相平行，这样区与区间线条夹角最好保持120°左右。先将接种环蘸取少量菌在平板1区划3～5条平行线，取出接种环，左手关上皿盖，将平板转动60～70°，右手把接种环上多余菌体烧死，将烧红的接种环在平板边缘冷却，再按以上方法以1区划线的菌体为菌源，由1区向2区作第2次平行划线。第2次划线完毕，同时再把平皿转动约60～70°同样依次在3、4区划线。划线完毕，灼烧接种环，关上皿盖，同上法培养，在划线区观察单菌落。
本次实验在分离细菌的平板上选取单菌落，于肉膏蛋白胨平板上再次划线分离，使菌进一步纯化。划线接种后的平板，倒置于30℃恒温箱中培养24h后观察结果。
3. 微生物菌落计数(平板菌落计数法)
含菌样品的微生物经稀释分离培养后，每一个活菌细胞可以在平板上繁殖形成一个肉眼可见的菌落。故可根据平板上菌落的数目，推算出每克含菌样品中所含的活菌总数。
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每克样品中微生物的活细胞数＝同一稀释度3个平板上菌落平均数含菌样品克数?稀释倍数
一般由三个稀释度计算出的每克含菌样品中的总活菌数和同一稀释度出现的总活菌数均应很接近，不同稀释度平板上出现的菌落数应呈规律性地减少。如相差较大，表示操作不精确。通常以第二个稀释度的平板上出现50个左右菌落为好。也可用菌落计数器计数。
4. 平板菌落形态及个体形态观察
从不同平板上选择不同类型菌落用肉眼观察，区分细菌、放线菌、酵母菌和霉菌的菌落形态特征。并用接种环挑菌，视其与基质结合紧密程度。再用接种环挑取不同菌落制片，在显微镜下进行个体形态观察。将所分离的含菌样品中明显不同的各类菌株的主要菌落特征和细胞形态记录于表2－4。
5. 分离纯化菌株转接斜面(斜面接种)
在分离细菌、放线菌、酵母菌和霉菌的不同平板上选择分离效果较好，认为已经纯化的菌落各挑选一个用接种环接种斜面。将细菌接种于肉膏蛋白胨斜面，放线菌接种于高氏1号斜面，酵母菌和霉菌接种于豆芽汁葡萄糖斜面上。
贴好标签，在各自适宜的温度下培养，培养后观察是否为纯种，记录斜面培养条件及菌苔特征于表2－5。置冰箱保藏。
（五）实验报告内容
1. 简述分离微生物纯种的原则及列出分离操作过程的关键无菌操作技术。 2. 记录微生物四大类菌的分离方法及培养条件于表4－2。
表4－2 微生物四大类菌的分离方法及培养条件 分离对象 细 菌 放线菌 霉 菌 酵母菌 样品来源 土 壤 土 壤 土 壤 果园土或面肥 分离方法 稀释度 培养基 培养温度 培养时间 3. 将你所分离的微生物平板菌落计数结果填入表4－3中。
表4－3 平均每克样品所含微生物数 皿 第1皿 第2皿 第3皿
每皿长出菌落数 10－ 10－ 45
每克样品所含菌数 10－ 10－ 10－ 10－
均值 4. 将你所分离样品中单菌落菌株的菌落培养特征与镜检形态记录于表4－4。 表4－4 含菌样品中分离的菌株特征记录 分离日期 地点 菌株编号 分离培养基 菌落特征 镜检形态 5. 记录斜面培养条件及菌苔特征(包括纯化结果)于表4－5。
表4－5 微生物四大类菌的斜面培养条件及菌苔特征
微生物 细 菌 放线菌 酵母菌 霉 菌 6. 请设计分离筛选下列微生物菌种的试验方案(任选一种)。
提示：包括采样、稀释液制备、培养基名称、培养温度、培养时间、分离纯化方法等。 (1) 酸奶中乳酸菌的分离、纯化。 (2) 土壤中链霉素产生菌的分离、纯化。
(3) 啤酒泥或酒曲发酵窖泥中酵母菌分离、纯化。 (4) 甜酒药曲或酿酒种曲中霉菌的分离、纯化。
（六）思考题
1. 稀释分离时，为什么要将已融化的琼脂培养基冷却到45～50℃左右才能倾入到装有菌液的培养皿内?
2. 划线分离时为什么每次都要将接种环上多余菌体烧掉?划线时为何不能重迭? 3. 在恒温箱中培养微生物时为何培养皿均需倒置?
4. 分离某类微生物时培养皿中出现其它类微生物，请说明原因?应该如何进一步分离和纯化?经过一次分离的菌种是否皆为纯种?若不纯，应采用哪种分离方法最合适? 5. 根据哪些菌落特征可区分细菌、放线菌、酵母菌与霉菌?它们的细胞结构表现在菌落形态上有什么联系?
培养基名称 培养温度 养培时间 菌苔特征 纯化程度 实验五 环境因素对微生物生长的影响
（一）目的要求
了解某些物理因素、化学因素和生物因素对微生物生长的影响及芽孢对不良环境的抵抗能力。
（二）基本原理
环境因素(包括物理因素、化学因素和生物因素)，如温度、渗透压、紫外线、pH、氧气、
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某些化学药品及拮抗菌等对微生物的生长繁殖、生理生化过程产生影响。不良的环境条件使微生物的生长受到抑制，甚至导致菌体的死亡。但是某些微生物产生的芽孢，对恶劣的环境条件有较强的抵抗能力。我们可以通过控制环境条件，使有害微生物的生长繁殖受到抑制，甚至被杀死；而使有益微生物得到发展。
（三）实验材料 1. 菌种
金黄色葡萄球菌。 2. 培养基
肉膏蛋白胨培养基。 3. 其它物品
培养皿、无菌圆滤纸片、镊子、无菌水、无菌滴管、水浴锅、紫外线灯、黑纸。 4. 药品
青霉素、来苏儿水、新洁尔灭、甲醛、乙醇。
（四）实验步骤
1. 物理因素对微生物生长的影响
紫外线主要作用于细胞内的DNA，使同一条链DNA相邻嘧啶间形成胸腺嘧啶二聚体，引起双链结构扭曲变形，阻碍碱基正常配对，从而抑制DNA的复制，轻则使微生物发生突变；重则造成微生物死亡。紫外线照射的剂量与所用紫外光灯的功率(瓦数)、照射距离和照射时间有关。当紫外光灯和照射距离固定，照射的时间越长则照射的剂量越高。紫外线透过物质的能力弱，一层黑纸足以挡住紫外线的通过。本实验是验证紫外线的杀菌作用及不同微生物对紫外线的抵抗能力。
(1) 取肉膏蛋白胨培养基平板3个，分别标明大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球等实验菌的名称。
(2) 分别用无菌移液管取培养18～20h的大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌菌液0.1ml(或2滴)，加在相应的平板上，再用无菌涂棒涂布均匀，然后用无菌黑纸遮盖部分平板。
(3) 紫外灯预热10～15 min后，把盖有黑纸的平板置紫外灯下，打开培养皿盖，紫外线照射20 min(照射的剂量以平板没有被黑纸遮盖的部位，有少量菌落出现为宜)，取去黑纸，盖上皿盖。
(4) 37℃培养24h后观察结果，比较并记录三种菌对紫外线的抵抗能力。
2. 不同药物的杀菌实验
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图7－18 紫外线照射对微生物生长的影响
(1) 取培养18～20h的大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌斜面各1支，分别加入4 ml无菌水，用接种环将菌苔轻轻刮下、振荡，制成均匀的菌悬液。
(2) 取3个无菌培养皿，每实验菌一皿，在皿底写明菌名及测试药品名称。 (3) 分别用无菌滴管加菌4滴(或0.2m1)菌液于相应的无菌培养皿中。
(4) 将融化并冷却至45～50℃的肉膏蛋白胨培养基倾入皿中约15 ml，迅速与菌液混匀，冷凝，制成含菌平板。
(5) 用镊子取分别浸泡在5%石炭酸、10%青霉素、5%新洁尔灭、40%甲醛和75%乙醇药品溶液中的圆滤纸片各一张，置于同一含菌平板上。
(6) 将平板倒置于37℃温箱中，培养24h后观察结果，测量并记录抑菌圈的直径。根据其直径的大小，可初步确定测试药品的抑菌效能。
（五）实验报告内容
1. 根据实验结果，将不同物理因素对微生物生长的影响记录于表7－1。
表7－1 不同物理因素对微生物生长的影响 不 同 因 素 紫外线 测试微生物 金黄色葡萄球菌 处理方式和结果 距离30cm、功率20W、照射20min *抗高温能力以温度和时间表示；紫外线以紫外灯的功率及照射的时间和菌种与紫外灯的距离表示。
2. 将不同药物对微生物生长的影响记录于表7－2。
表7－2 不同药物对微生物生长的影响 实验药品 10％青霉素 1％新洁尔灭 5％来苏儿水 40％甲醛 75％乙醇
（六）思考题
1.上述多个实验中，为什么选用金黄色葡萄球菌作为实验菌?
大肠杆菌 枯草芽孢杆菌 金黄色葡萄球菌 实验六 微生物深层培养生产α-淀粉酶及其酶活测定
微生物发酵亦称微生物工程，是生物工程的重要组成和基础。利用基因工程、蛋白质工程、细胞融合等技术为人们开创了构建新的具有各种生产能力、性能优良的物种的新天地，
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为发酵工程产品增加了许多新的内容，使现代发酵产品的发酵水平有了很大的提高。但是，充分发挥它们的作用，仍然需要依靠发酵技术的进步，为使利用各种技术手段得到的新物种能大量、高效、高质量的生产目的产物，要解决在大规模生产过程中必需解决的所有问题，应该说，这是发酵工程的研究任务。近年来，由于代谢调控技术、连续发酵技术、高密培养技术、固定化增殖细胞技术、反应器设计、发酵与分离偶联技术、在线检测技术、自控和计算机控制技术、产物的分离纯化等所需的技术的发展，以及工艺、设备和工程等研究的进步，使发酵工程达到了一个新的高度，发酵工业的自动化、连续化成为可能。微生物发酵既是开发生物资源的关键技术，也是生物技术产业化的重要环节。
由于微生物代谢类型的多样性，利用不同微生物对同一种物质进行发酵，以及同一种微生物在不同条件下发酵，其产物均不相同。根据微生物对氧的要求和发酵采用的方式不同，可将发酵分为以下2种类型。
(一) 按微生物对氧的要求分类 l．需氧性发酵(好气性发酵)
发酵产物形成时需要供给充分的氧气。如柠檬酸发酵、青霉素发酵、淀粉酶发酵、曲酸发酵等等。
2．厌氧性发酵(嫌气性发酵)
发酵时不需供应氧气。如丙酮-丁醇发酵、甲烷发酵、丙酸发酵、丁酸发酵等。 3．兼性厌气发酵
同一微生物在供氧和缺氧条件下发酵，产物不同。如生产酒精的酵母菌是一种兼性厌气微生物，在缺氧条件下进行酒精发酵，积累酒精，在大量通气情况下则进行好气性发酵，产生大量酵母细胞。
(二) 按发酵方式分类 l．固体发酵
即发酵的原料按比例与一定量的水分混合后进行灭菌，然后接种菌种，铺放在曲盘内或放在草席上或放在地面上成薄层，或放在水泥制的通风池内进行发酵。此法发酵时间长，劳动强度大，占地面积多，而且容易污染，不易进行纯种发酵。但固体发酵具有简单易行，投资少，适宜小型生产等特点，所以至今仍有很大应用价值。例如在农村中制造菌肥，发酵饲料、细菌农药，以及一些传统的食品如饮料、酒、酱油、醋等仍广泛采用固体发酵。
2．液体发酵
为满足微生物对氧的需求，此法最早是将所用原料配制成液体状态，放在瓷盘内，进行静置培养叫浅盘发酵。此法因劳动强度大、占地面积多、产量小、易污染等缺点，很快被液体深层发酵所代替。将原料与水配制成培养液加入到铁或不锈钢制成的密闭的发酵罐内，在罐中进行深层发酵。目前我国和世界大多数国家的发酵工厂均采用液体深层发酵。过去多采用单罐间歇发酵，后来又发展了连续发酵的方式；近年来固定化酶和固定化细胞技术的发展更促进了发酵工业的连续化和自动化。
微生物工程包括从投入原料到获得最终产品的完整过程，一般分为两个阶段，第一个阶
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