实验1

大肠杆菌的培养和分离

重 点 难 点 1.微生物实验的无菌操作。 2.利用LB液体培养基进行细菌培养。 3.利用LB固体培养基分离大肠杆菌。 4.划线分离法和涂布分离法。 课 标 解 读 1.进行大肠杆菌的扩增，利用液体培养基进行细菌培养的操作。 2.进行大肠杆菌的分离，用固体平面培养基进行细菌的划线培养。 3.说明大肠杆菌培养的条件和实验原理。

一、大肠杆菌

1．大肠杆菌是革兰氏阴性、兼性厌氧的肠道杆菌。

2．在肠道中，大肠杆菌一般对人无害，但也有一些菌株可以侵袭肠黏膜并产生毒素，任何大肠杆菌如果进入人的泌尿系统，都会对人体产生危害。

3．大肠杆菌是基因工程技术中被广泛采用的工具。 二、实验内容

1．本实验的内容是将大肠杆菌扩大培养和划线分离。分离后，一个菌体便会形成一个菌落，这是消除污染杂菌的通用方法，也是用于筛选高表达量菌株的最简便方法之一。

2．本实验用LB液体培养基(通用的细菌培养基)扩大培养大肠杆菌。培养后再在LB固体平面培养基上划线进行分离，随后培养基上便会形成一个个单独的菌落。

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三、细菌的培养和分离

1．细菌以分裂的方式繁殖，分裂速度很快，约20分钟分裂一次。人们在培养细菌时，一般用接种环转移带菌的培养物。接种时，先将接种环在明火上烧红后冷却，再操作。

2．细菌的分离

(1)划线分离法：在液体培养基中，只要接种后培养8 h，每毫升培养基中就有几亿个细菌。可用接种环蘸菌液在含有固体培养基的培养皿平板上划线，在划线过程中接种环上的菌液逐渐减少，因此，划线到最后，可使细菌间的距离加大。在固体培养基培养10～20 h后，可由一个细菌产生单菌落，菌落不会重叠。如果再将每个菌落分别接种至含有固体培养基的试管斜面上，在斜面上划线，则每个斜面的菌群就是由一个细菌产生的后代。这种方法也可用于分离细菌，将污染的杂菌除去。

接种环在取菌种前和划线前都要灼烧、而后都要冷却、操作完毕后又要灼烧的原因是什么？

【提示】 取菌种前灼烧接种环的目的是消灭接种环上的微生物；除第一次划线外，其余划线前都要灼烧接种环的目的是消灭接种环上残留菌种；取菌种和划线前都要求接种环冷却后进行，目的是防止高温杀死菌种；最后灼烧接种环的目的是防止细菌污染环境和操作者。

(2)涂布分离法：先将培养的菌液稀释，通常稀释10－5～10－7倍，然后取0.1 mL不同稀释度的稀释菌液加在培养皿的固体培养基上，用玻璃刮刀涂布在培养基平面上进行培养，在适当的稀释度下，可产生相互分开的菌落。通常每个培养皿有20个以内的单菌落最为适合。将每个菌落分别接种在斜面上扩增培养后，再做功能性实验。

细菌的两种分离法各有优点，都可采用。划线分离法，方法简单；涂布分离法，单菌落更易分开，但操作复杂些。

四、灭菌操作

1．各种器皿必须是无菌的：实验用具用牛皮纸或报纸包好，所有容器都先封口，然后进行高压蒸汽灭菌(1 kg/cm2压力、121 ℃、15 min)处理，并在超净台上使用。

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注意：实验中所需棉花不能用脱脂棉，因为脱脂棉易吸水。 2．各种培养基必须是无菌的。

3．细菌转移过程要避免杂菌污染和菌种外泄。

注意：培养皿需倒置，防止冷凝后形成的水珠滴落在培养基上污染培养基，冲散菌落。

五、大肠杆菌培养与分离的实验步骤

1．在两个250 mL三角瓶中分别装入50 mL LB液体培养基和50 mL LB固体培养基，加上封口膜。将培养皿包好，连同培养基一同灭菌15 min。

2．灭菌后待培养基冷却至60 ℃时，关闭紫外灯，点燃酒精灯，并用酒精棉球擦拭桌面和实验者的手。在酒精灯火焰旁用右手持盛有固体培养基的三角瓶，左手拿培养皿，并将培养基倒入4个培养皿中，将培养皿置于水平位置上，待其凝固。

为什么要在酒精灯火焰旁进行操作？

【提示】 酒精灯火焰旁约10 cm的空间是一个无菌区，在酒精灯火焰旁操作能防止杂菌污染。

3．扩大培养

先将接种环在酒精灯火焰上烧红，再深入到大肠杆菌斜面，使环冷却后，取菌体，并将菌体放入三角瓶液体培养基中，封瓶后在37 ℃每分钟200转的摇床上振荡培养12 h。

4．划线分离

用在酒精灯火焰上灼烧后的接种环深入到摇床上培养后的菌液中，然后在固体培养基的平板上连续划线，接种环需蘸菌液1次，划线后盖好皿盖，将培养皿倒置，在37 ℃，恒温培养箱中培养12～24 h后，可在划线的末端出现不连续的单个菌落，表明菌已被分离。

5. 在无菌操作下将单菌落用接种环取出，再用划线法接种在斜面上，37 ℃培养24 h后，置于4 ℃冰箱中保存。

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微生物培养的基本条件 1.培养基及其类型 (1)培养基：①概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质，此即培养基。

②作用：在提供主要营养物质的基础上，培养基还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质及O2的需求，如培养乳酸杆菌时需在培养基中添加维生素，培养霉菌时需将pH调至酸性，培养厌氧型微生物需给予无氧条件等。

(2)培养基的种类 划分标准 培养基种类 液体培养基 半固体培养物理性质 基 加凝固剂，如琼脂 固体培养基 培养基中加入某种化学物质，以抑制用途 选择培养基 不需要的微生物的生长，促进所需要的微生物的生长 根据微生物的代谢用途 鉴别培养基 特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品 2.无菌技术 进行微生物培养获得纯净培养物的关键是防止杂菌污染，无菌技术即围绕着如何避免杂菌的污染展开，主要包括以下几个方面：

(1)对实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行清洁和消毒。 (2)将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌。

特点 不加凝固剂 用途 微生物的扩大培养、工业生产 观察微生物的运动、分类鉴定 微生物分离、鉴定、活菌计数、保藏菌种 培养、分离出特定微生物(如培养酵母菌和霉菌，可在培养基中加入青霉素；培养金黄色葡萄球菌，可在培养基中加入高浓度食盐) 鉴别不同种类的微生物，如可用伊红—美蓝培养基鉴别饮用水或乳制品中是否有大肠杆菌(若有，菌落呈深紫色，并带有金属光泽) 4