(3)为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行。 (4)实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。 3．消毒和灭菌的比较 概念 使用较为温和的物理或化学方消毒 法，杀死物体表面或内部的部分微生物(不包括芽孢和孢子) 使用强烈的理化灭菌 因素杀死物体内外所有的微生物(包括芽孢和孢子) 化学药剂消毒法 灼烧灭菌：酒精灯火焰 干热灭菌：干热灭菌箱内160～170 ℃下灭菌1～2 h 高压蒸汽灭菌：121 ℃条件下，灭菌15～30 min 常用方法 煮沸消毒法：在100 ℃开水中煮沸5～6 min 应用的范围 一般物品 巴氏消毒法：70～75 ℃煮30 对于一些不耐高温的min或在80 ℃煮15 min 液体，如牛奶 如用酒精擦拭双手、用氯气消毒水源等 接种工具的灭菌 玻璃器皿、金属工具的灭菌 培养基及容器的灭菌 注：消毒与灭菌的最大区别是芽孢和孢子能否存活 某小组同学为了调查湖水中细菌的污染情况而进行了实验。实验包括制备培养基、灭菌、接种及培养、菌落观察计数。请回答与此实验相关的问题。

(1)制备培养基：根据物理性质的不同，可以将培养基分为液体、半固体和固体培养基。对细菌进行大量的扩增，用________培养基进行培养；对细菌进行分离，用________培养基进行培养。

(2)灭菌：在培养微生物时必须进行无菌操作，包括各种________都必须是无菌的。对它们进行灭菌，通常用________法灭菌。

(3)接种及培养：接种时常用的工具是________和玻璃三角刮刀。 为了尽快观察到细菌培养的实验结果，应将接种了湖水样品的平板置于________中培养，培养的温度设定在37 ℃。要使该实验所得结果可靠，还应该同时在另一平板上接种________作为对照进行实验。

(4)菌落观察计数：培养20小时后，观察到平板上有形态和颜色不同的菌落，这说明湖水样品中有________种细菌。一般说来，菌落总数越多，湖水遭受细菌污染的程度越________。

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(5)选择培养基是在培养基中加入某种化学物质，以抑制不需要的微生物的生长，促进所需要的微生物的生长。如果提高培养基中NaCl的浓度，可以用于筛选耐________细菌。

【思路点拨】 (1)细菌扩大培养用液体培养基，分离用固体培养基。(2)无菌操作包括所有的器皿要无菌，所有的培养基要无菌，接种过程要防止杂菌污染。实验室中常用高压蒸汽灭菌法。(3)接种时常用接种环，用恒温培养箱保持温度。在实验过程中，除实验变量以外的其他各变量应适宜且相同，以利于更好地实现实验目的。(4)不同的菌落具有各自不同的菌落特征(如硬度、颜色、透明度、光滑度等。)(5)选择培养基可以将所需要的微生物从混杂的微生物中分离出来。

【答案】 (1)液体 固体平面 (2)器皿和培养基 高压蒸汽灭菌 (3)接种环 恒温培养箱 无菌水 (4)多 高 (5)盐(或NaCl)

1．细菌培养过程中分别采用了高压蒸汽、用酒精棉球擦试、火焰灼烧等几种不同的处理，这些方法依次用于杀灭哪些部位的杂菌( )

A．接种环、手、培养基 C．培养基、手、接种环

B．高压锅、手、接种环 D．接种环、手、高压锅

【解析】 此题考查对无菌技术的掌握。高压蒸汽灭菌锅是灭菌的一个设备，通常用于培养基的灭菌。用酒精擦拭双手是消毒的一种方法。火焰灼烧，可以迅速彻底地灭菌，适用于微生物接种工具的灭菌，如接种环。

【答案】 C

大肠杆菌的培养和分离 1.LB培养基的制备 (1)计算：根据LB培养基配方的比例，计算配制50 mL 的培养基时各种成分的用量。

(2)称量：准确地称取各种成分。即：蛋白胨0.5 g、酵母提取物0.25 g、氯化钠0.5 g，加水50 mL。(如配LB固体培养基，则再加1 g 琼脂)

(3)制备空白斜面：将LB液体培养基配好，加入琼脂并加热使之融化后，通过玻璃漏斗加入试管中，每试管2 mL，加棉塞并将试管捆在一起，上端加盖一张牛皮纸，灭菌。灭菌后斜靠于平放的铅笔上，冷却后即成空白斜面培养基。

2．进行大肠杆菌培养与分离操作

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(1)灭菌

??置于灭菌锅1 kg压力

250 mL三角瓶乙→50 mL?

灭菌15 min

LB固体培养基?尚未凝固?

??牛皮纸包好的培养皿

LB液体培养基

250 mL三角瓶甲 →50 mL

(2)制备LB固体平面培养基——倒平板操作

待培养基冷却至60 ℃左右时，在酒精灯火焰附近倒平板。倒平板的具体操作描述如下：

(3)扩大培养

①左手持大肠杆菌斜面和有液体培养基的三角瓶，右手拿接种环并用无名指、小指夹住斜面的棉塞和三角瓶封口膜。

②将接种环在火焰上烧红，再深入到斜面，使其冷却后取菌体。 ③将菌体放入三角瓶液体培养基中(将封口膜及斜面棉塞复原)。 ④三角瓶在37 ℃摇床振荡培养12 h。 (4)划线分离 ①取种

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在酒精灯火焰上灼烧接种环，将上述培养后的菌液打开，接种环部分深入到菌液中取种。

②平板划线操作

在LB固体培养基的平板上连续划线(如下图所示)，划线后盖好培养皿。

③培养

将上述划线操作后的培养皿倒置放至37 ℃恒温培养箱中培养12～24 h，可看到划线的末端出现不连续的单个菌落，表明菌已被分离。

(5)菌种纯化与保藏

在无菌操作下，将单菌落用接种环取出，再用划线法接种至斜面上，37 ℃培养24 h后，4 ℃冰箱保存即可。

划线的目的是将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面，以期在连续划线后，可以分离到由单个细胞繁殖而来的子细胞群体(菌落)，从而达到纯化菌种的目的，为此，在划线操作时，接种环只需在菌液中蘸取菌液一次，且作第二次及其以后的划线操作时，须从上一次划线的末端划线——如此可使菌体数量随划线次数的增加而减少，并逐步分散，最终实现在平板上得到单菌落的目的。

下图为“大肠杆菌的培养和分离”实验的基本流程： A.灭菌

→

B.倒平板

→

C.接种和培养

?液体培养基?

→

D.划线分离和培养

→E.菌种保存

请回答：

(1)灭菌常用________法，灭菌后，要待________________时才能打开锅盖。 (2)倒平板和接种前要用________擦手。接种和划线前使用________的方法对接种环灭菌。

(3)划线分离时，接种环在菌液中蘸取________次。下图甲表示在平板培养基上的第一次和第二次划线，请在乙图中画出第三次划线。

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