第五章盐皮影响青鳞鱼Ｎａ＋一Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅａ、８和ＧＲ基因表达的研究３３５．７青鳊鱼适应千分之十五盐度后，转入淡水，鳃内不同时间段ＧＲ基因表达的变化图５—６青鳞鱼适应千分之十五盐度后，转入淡水，鳃内不同时间段ＧＲ基因表达的变化。转入淡水不同时间段检测ＧＲ基因表达量均显著降低。ＧＲ基因在３ｈ的表达量为Ｏ．００００８６＿＋０．００００１２、１２ｈＯ．００００８７＿＋０．００００５１、２４ｈ０．０００１４８＿＋０．００００２３、４８ｈ０．０００１９９±ｏ．０００１１５、９６ｈ０．０００１９８＿＋０．００００８９。５．８讨论本文用实时定量ＲＴ—ＰＣＲ，准确地检测了盐度对青鲻鱼Ｎａ＋一Ｋ＋．ＡＴＰａｓｅａ和Ｎａ＋一Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅ８、ＧＲ基因表达的影响，为硬骨鱼类渗透压调节的分子机制提供了基础数据。ａ、本文实验结果表明成年青鲔鱼暴露在千分之十五的盐水中，鳃内Ｎａ＋一Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅＧＲｍＲＮＡ水平显著升高（ｐ＜Ｏ．０５），Ｎａ＋一Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅＢ基因表达无显著性变化。２００５年，ａＥｄｄｉｅ等报道了海鲷鳃体外暴露１０ｎｇ，／ｍｌ皮质醇，鳃内Ｎａ＋．Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅｍＲＮＡ水平显著升高，Ｎａ＋?Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅＢ基因表达无显著性变化，与本实验结果一致“１。由于皮质醇的各种生物学功能都是由特异性胞内糖皮质醇受体（ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＧＲ）介导的”２一，所以本文检测到鳃内ＧＲｍＲＮＡ水平显著升高合乎皮质醇的作用机理。图５—４表明，当适应较高盐度后转移到淡水中１２ｄ，时，鳃ｔ为Ｎａ＋－Ｋ＿．ＡＴＰａｓｅａｍＲＮＡ水平降到低谷，而后随时间的增长，Ｎａ＋－Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅａｍＲＮＡ水平逐渐恢复正常，其变化趋势呈“ｕ”型。而Ｎａ＋－Ｋ＋．ＡＴＰａｓｅＢ基因的表达水平（图５．５），仅有变化趋势，和盐水组相比差异不显著。ＧＲ基因在转入淡水后表达水平迅速降低（图５，６），然后随时阃的延长，逐渐增加。为什么Ｎａ＋一Ｋ＋ＡＴＰａｓｅａ、ＧＲ基因表达在转入淡水后有一段时间是低于对照组呢？目前未找到合理的原因来解释。但本实验结果能够说明，盐度引起青鳝鱼鳃内Ｎａ＋．Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅａ和ＧＲ基因表达变化。然而是不是ＧＲ基因表达的增加才引起Ｎａ＋一Ｋ＋．ＡＴＰａｓｅａ基因表达水平升高，需进一步研究。在鱼类，盐度对肠和肌肉内Ｎａ＋．Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅａ、Ｂ、ＧＲ基因表达的研究，目前为止未见报道。从图５—１、５－２、５—３可以看出，在青鲻鱼适应千分之十五的赫度后，肠内Ｎａ＋－Ｋ＋一ＡＴＰａｓｅａ基因表达量显著升高，Ｎａ＋一Ｋ＋一ＡＴＰａｓｅＢ、ＧＲ基因无显著变化，只有升高趋势。肌肉内Ｎａ＋一Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅａ基因表达无显著变化，Ｎａ＋．Ｋ＋．ＡＴＰａｓｅＢ、ＧＲ基因显著降低。５．９本章结论青鳓鱼暴露在千分之十五的盐水中，鳃内Ｎａ＋．Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅａ、ＧＲｍＲＮＡ水平显著升高（ｐ＜Ｏ．０５），Ｎａ＋?Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅＢ基因表达无显著性变化。肠内Ｎａ＋一Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅａ基因表达量显著升高，Ｎａ＋一Ｋ＋．ＡＴＰａｓｅＢ、ＧＲ基因无显著变化，但二者有升高趋势。肌肉内Ｎａ＋一Ｋ＋一ＡＴＰａｓｅａ基因表达无显著变化，Ｎａ＋．Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅＢ、ＧＲ基因显著降低。青鲋鱼鳃内№。Ｋ‘－ＡＴＰａｓｅ基因的克隆及皮质醇对其表达的影响当青鲻鱼适应１５９／Ｌ的盐水后，转移到淡水中，在不同时间段检测其鳃内Ｎａ＋一Ｋ＋．ＡＴＰａｓｅａ、Ｎａ＋．Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅＢ和ＧＲ基因表达的变化，鳃内Ｎａ＋一Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅａｍＲＮＡ水平，随时间变化成“ｕ”型趋势，即１２小时降到低谷，而后随时问的增长逐渐恢复正常。Ｎａ＋一Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅＢ基因的表达水平和盐水组相比变化不显著。从图５—６可看出，青鲻鱼转入淡水后鳃内ＧＲ基因表达水平急剧降低，但随时问的延长，ＧＲ基因表达水平逐渐增加。此结果对阐明鱼类渗透压调节的分子机制有重要作用。第六章水环境中皮质醇影响青鳓鱼鳃出Ｎａ＋－Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅａ、１３和ＧＲ基因表达的研究３５第六章水环境中皮质醇影响青鳟鱼鳃内Ｎａ＋－Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅｎ、Ｂ和ＧＲ基因表达的研究６．１引言天然皮质醇（ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ，氢化可的松）是由肾上腺皮质束状带细胞合成和分泌的一种糖皮质激素。通常情况下，血液中皮质醇含量较低，遇到突发有害状况时，血液皮质醇会迅速增高，使动物处于应激状态，对有害环境迅速做出反应。由于对皮质醇的构效关系较为明确，因而除天然的皮质醇已能合成外，还出现了许多人工合成的皮质醇及其类似物（如强的松、丁酸氢化可的松等），目前作为临床药物广泛应用于抗炎、抗病毒、抑制免疫力、抗休克及抢救危机病人等。但是，这类物质的也具有副作用如水电解质平衡失调、骨质硫松、免疫力下降、自身肾上腺萎缩、药源性皮质醇增多症、诱发溃疡病、促发精神异常、儿童生长发育异常等“…。我国每年生产的皮质醇及其类似物药物达数百吨，仅天津某一厂家年产氢化可的松就达２０吨之多，另外在生产过程中的大量中间产物和提纯过程中的成品流失也不容忽视…“。除了医药品使用造成的环境污染以外，人体排放也是一个重要的污染源。众所周知，源于人类排泄的天然雌激素污染已经成为一个环境问题，而人类尿液中皮质醇的排放量约为雌二醇的１００．１０００倍。所以，环境中存在着潜在的皮质醇及其类似物的环境污染。但是到目前为止有关此类物质潜在的生态危害性研究还没有引起足够的重视，亟待深入研究。在鱼类等低等脊椎动物中，皮质醇是一种最主要的肾上腺皮质激素。一些研究表明，在胁迫环境（如高温、高盐、缺氧、被捕食）中，鱼类血清皮质醇水平升高，从而引起一系列的生理生化反应（如促进糖代谢），为适应性反应提供能量和物质基础。“２”。还有许多研究证明皮质醇对洄游鱼类的水盐平衡的调整起重要作用，它能增加鳃上皮的使氯细胞密度增加，增强Ｎａ＋一Ｋ＋一ＡＴＰ酶的活性，促使离子通过鳃排出体外…“１。血清皮质醇的正常变化对过程中的渗透平衡调节至关重要。２’“２”，因此环境皮质醇的污染可能破坏海河洄游鱼类渗透平衡的调节。如果正常血清皮质醇平衡受到外界干扰将可能引起洄游鱼类的渗透压调节失败，使大量洄游鱼类死于河１：３。最近几十年来，许多洄游鱼类如鲟鱼、鲥鱼、胭脂鱼等的种群数量急剧降低，是否与皮质醇及其类似物的污染有关值得探索ｏ“２５’２“２”。所以本文将适应千分之十五盐度的成体青鲻鱼，转入到含有０．０１１ｕｌａｇ／Ｌ、０．１ｌａｇ／Ｌ、ａ、ｇ／Ｌ、１０ｌａ班、１００ｌａｇ／Ｌ皮质醇中，研究水环境中的皮质醇对鳃内Ｎａ４－Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅ１３、ＧＲ基因表达的影响，以此来评价水环境中的皮质醇对洄游鱼类渗透压调节的潜在危害性。３６青鲋鱼鳃内Ｎａ。Ｋ’－ＡＴＰａｓｅ基因的克隆及皮质醇对其表达的影响６．２青鳟鱼暴露皮质醇鳃内Ｎａ＋－Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅＱ基因表达变化藿鼍薰ｌｆ广］广］广］㈠＾＾＾ｌ＊等毫茸■０．００１苎呈０兰ｓａｌｉｎｉｔｙＩ）ＭＳ０００１ｕｇ／Ｌ０１ｕｇ／Ｌ１ｕｇ／Ｌ１０ｐｇ／Ｌ１００ｕｇ／Ｌ是暑鲁图６－１实时定量ＲＴ－ＰＣＲ，ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ荧光染料法对对照组（０．００５％ＤＭＳＯ）、暴露皮质醇（０．０ｌ、０．１、１、１０、１００＃ｇ／Ｌ）各组青鲥筝鱼鳃内Ｎａ＋一Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅａ基因表达定量结果．抽＝６，ｍｅａｎ！ｓＤ．?实验组与对照组相比差异显著（口（Ｏ．０５））。Ｆｉｇ．６－１Ｎａｄ－Ｋ。－ＡＴＰａｓｅａｇｅｎｅｓｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｇｉｌｌｏｆｍｅｄａｋａｉｎｃｏｎｔｒｏｌ（０．００５％ＤＭＳＯ），ｈｙｃｏｒｔｉｓｏｌ（０．０１、Ｏ．１、ｌ、１０、１００＃ｇ／Ｌ）ｅｘｐｏｓｅｄｇｒｏｕｐｓｂｙｒｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲ，ＳＹＢＲＧｒｅｅｎｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．ｍ＝６，ｍｅａｎ！ｓＤ．’Ｐ＜０．０５）．６．３青鳝鱼暴露皮质醇鳃内Ｎａ＋－Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅＢ基因表达变化从图６．２中可以看出，暴露皮质醇各组青鳓鱼鳃内Ｎａ＋．Ｋ＋．ＡＴＰａｓｅＢ基因表达量同对照组（ＤＭＳＯ）相比无显著性变化。对照组青鲻鱼鳃内Ｎａ＋一Ｋ＋－ＡＴＰａｓｅ１３的ｍＲＮＡ水平为０．２４６５１３＿＋０．０３８４６８。１００、１０、１．Ｏ、０．１，ｇ／Ｌ皮质醇暴露组的Ｎａ＋一Ｋ＋．ＡＴＰａｓｅ８基因表达水平分别为０．３２０４７３＿＋０．０５９５３３、０．３２８７０４±０．０５５９８、０．２７４３２±Ｏ．０３３６５７、０．２９２２０８±Ｏ．１０１９３３和０．２６１４２７＿＋０．１０８３４。６．４青鳝鱼暴露皮质醇鳃内ＧＲ基因表达变化图６—３为青鲜鱼暴露皮质醇鳃内ＧＲ基因表达的变化。皮质醇０．１＃ｇ／Ｌ、ｌ＃ｇ／Ｌ、１０＃ｇ／Ｌ和１０Ｑ“ｇ／Ｌ暴露组鳃内ＧＲ基因表达量与对照组（ＤＭＳＯ）相比显著升高（Ｐ＜０．０５）。ＤＭＳＯ组鳃内ＧＲ的ｍＲＮＡ水平为０．０００１５５－＋０．００００３５。皮质醇暴露组鳃内ＧＲ基因表达量分别为Ｏ．０００１５ｌ＋０．００００４（Ｏ．０１肚∥Ｌ）、０．０００２４２±０．００００４１（０．１肛譬，Ｌ）、０．０００２３３