附件2：
项目编号
北京林业大学
国家级大学生创新创业训练计划
创新训练项目申请书
项目名称： 主 持 人： 联系电话： 指导教师： 起止年月： 申请日期：
王君
栓皮栎组培再生体系的构建及原生质体游离研究 宋少宇
专业年级
15201443936
生科10
职 称
副教授
生物科学与
学 院 技术学院
2012年1月—2013年12月
2012年4月20日
北京林业大学
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一、项目基本情况
项目名称 项目简介 栓皮栎组培再生体系的构建及原生质体游离研究 项目类别 申请经费 （元） 姓 名 √理工农类 □经管文法类 30000 起止年月 2012年1月——2013年12月 主持人 性别 学号 专业年级 联系电话 电子邮箱 angela-song@foxmail.com 项目分工 组培再生体系研究 组培再生体系研究 原生质体游离研究 原生质体游离研究 所在学院 生物科学与技术学院 宋少宇 女 100414217 生科10 15201443936 姓名 性别 学号 专业年级 所在学院 生物科学与技术学院 生物科学与技术学院 林学院 生物科学与技术学院 职务 项目组其他成员 李昌磊 男 100414203 生技10-2 曾青青 女 100414226 生科10 郭 倩 女 100114118 林学10-1 尚峰男 男 100414204 生科10 姓名 性别 年龄 职称 指导教师 王君 男 30 副教授 研究方向 林木倍性育种及细胞遗传学 联系电话 13401024121 电子邮箱 wangjun@bjfu.edu.cn 2
二、项目立项依据
（一）项目研究意义（限300字） 栓皮栎（Quercus varibilis）属壳斗科（Fagaceae）栎属（Quercus），树干通直，木材坚硬，抗腐蚀性强，树皮、果实及叶片等均有重要经济价值，是重要的硬阔用材和软木资源树种；同时，其分布广泛、适应性强，在维持地域生态平衡和生态系统恢复等方面具有重要作用。 然而，由于生长缓慢、控制授粉和无性繁殖困难，栓皮栎遗传改良研究相对滞后，主要集中在优树选择、种子园营建等方面，进一步加强栓皮栎遗传改良研究迫在眉睫。本项目以栓皮栎实生苗茎段为外植体，诱导愈伤组织并分化，构建再生体系；并在此基础上，分别以无菌苗叶片和愈伤组织为材料，研究原生质体游离条件，建立栓皮栎叶肉和愈伤组织原生质体游离技术体系，为进一步开展栓皮栎细胞工程途径遗传改良奠定基础。 （二）国、内外研究现状和发展动态，并附主要参考文献（限1000字） 植物原生质体为植物育种基础研究和遗传工程提供了一个方便的遗传操作实验系统。利用原生质体可以进行细胞融合和体细胞杂交，是一种创造远源杂种，获得同源或异源三倍体、四倍体以及双二倍体的新途径（Puite, 1992; Zeng et al., 2006）；原生质体又是植物基因工程的理想受体，可对外源基因、DNA片断、细胞器、染色体捕获创造一种新方法（Prols et al., 1988; Puite, 1992）。因此，开展植物原生质体游离、培养和细胞融合研究有重要的理论和实践意义。加强栎树原生质体游离与培养研究有望从细胞工程途径取得栎树遗传改良研究的突破。 植物原生质体游离最常用的方法是酶解法。用酶液分离原生质体，与起始材料、酶解时间、酶液成分和浓度等有密切关系。原生质体游离的起始材料通常采用由外植体诱导产生的愈伤组织、悬浮细胞、组织培养再生植株以及种子无菌萌发而来的叶片等。 常用于木本植物原生质体分离的酶类有纤维素酶（Cellulase R-10，Cellulase Rs）、果胶酶（Pectolase Y-23）、离析酶（Maerozyme R-10）、半纤维素酶（Hemicellulase）、崩溃酶（Driselase）等。不同植物，甚至同种植物的不同起始材料使用的酶的种类和浓度不尽相同。在山杏原生质体分离时添加0.5%半纤维素酶可明显提高原生质体产量，而山桃原生质体分离时加入0.5%半纤维素酶则对原生质体产量无影响（马锋旺和李嘉瑞，1998，1999）。酶解处理所遵循的原则是利用尽可能低的酶浓度和尽可能短的酶解时间获得大量有活力的原生质体(谢从华和柳俊，2004)。 原生质体分离时要求酶液和材料的比例合适才能有效分离原生质体。一般叶片、子叶需要量少，胚性愈伤组织和悬浮细胞需要量稍大，每克材料用酶量在10-20mL。酶解时间长短与材料和酶液的种类和浓度有关。酶解时间太短，酶解不充分，原生质体产量低;酶解时间太长，酶液会对原生质体产生毒性，原生质体有自溶现象，降低产量和活力 3
(何业华等，1999)。光照可能损伤刚分离的原生质体质膜，造成原生质体活力下降（谢从华和柳俊，2004），因此酶解过程通常在黑暗或弱光条件下进行。同时，酶解时辅以低速振荡能有效提高原生质体产量。在桃原生质体分离中，30-50rpm低速振荡酶解的原生质体产量是静置酶解的几倍(Mills et al., 1994)。 同时，为了保持原生质体的活力和膜的稳定性，酶液中常加入甘露醇、山梨醇、蔗糖和葡萄糖等糖类物质作为稳定剂来调节渗透压。稳定剂的使用浓度因植物材料的不同而异，一般为0.35-0.8M（朱至清，2003）。原生质体在轻微高渗溶液中比在等渗溶液中更为稳定，较高水平的渗透压可以有效抑制原生质体的破裂和出芽，但也可能影响原生质体的分裂。 目前有关栎属树种原生质体游离的研究较少，仅国外学者在美国红栎（Quercus rubra）、枹栎（Quercus serrata）等树种中有所报道，且原生质体主要来源于根器官和胚胎发生细胞系（Brison and Lamant, 1990; Sasamoto and Hosoi, 1992），相关研究亟待深入。 参考文献 [1] Brison M, Lamant A. Callus formation from root protoplasts of Quercus rubra L. (red oak). Plant Cell Rep., 1990, 9(3): 139-142. [2] Mills D, Hammerschlag FA. Isolation of cells and protoplasts from leaves of in vitro propagated Peach (Prunus persica) plants. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 1994, 36: 99-105. [3] Prols M, Topfer R, Schell J, Steinbib H. Transient gene expression in tobacco protoplasts: I. Time course of CAT appearance. Plant Cell Rep., 1988, 7:221-224. [4] Puite KJ. Progress in plant protoplast research. Physiol. Plant, 1992, 85(2): 403-410. [5] Sasamoto H, Hosoi Y. Callus proliferation from the protoplasts of embryogenic cells of Quercus serrata. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 1992, 29(3): 241-245. [6] Zeng SH, Chen CW, Hong L, Liu JH, Deng XX. In vitro induction, regeneration and analysis of autotetraploids derived from protoplasts and callus treated with colchicine in Citrus. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 2006. 87(1): 85-93. [7] 何业华, 胡芳名, 谢碧霞, 胡中沂, 何钢. 枣树原生质体分离条件的研究. 中南林学院学报, 1999, 19(l): 20-23. [8] 马锋旺, 李嘉瑞. 山桃原生质体培养再生愈伤组织. 山西农业学报, 1999, 8(3): 73-76. [9] 马锋旺, 李嘉瑞. 山杏原生质体培养再生植株. 园艺学报, 1998, 25(3): 224-229. [10] 谢从华, 柳俊. 植物细胞工程. 北京:高等教育出版社, 2004. [11] 朱至清. 植物细胞工程. 北京:化学工业出版社, 2003. 4