第３８卷分析化学（ＦＥＮＮＩＨＵＡＸＵＥ）研究报告第１２期２０１０年１２月ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｎａｌｙｔｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ１７５９～１７６４ＤＯＩ：１０．３７２４／ＳＰ．Ｊ．１０９６．２０１０．０１７５９液相色谱．串联质谱法测定饲料中１４种霉菌毒素及其类似物应永飞朱聪英韦敏珏陈慧华’屈健陆春波林仙军罗成江（浙江省畜产品质量安全检测中心，杭州３１００２０）摘要采用高效液相色谱－电喷雾串联质谱仪（ＬＣ．ＥＳＩ－ＭＳ—ＭＳ），在多反应监测（ＭＲＭ）模式下建立了饲料中玉米赤霉烯酮、黄曲霉毒素和单端孢霉烯族Ａ类毒素等１４种毒素及其类似物的快速确认测定方法。试样中的黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮和单端孢霉烯族Ａ类毒素经乙腈?水（８４：１６，ＷＶ）提取，正己烷脱脂及霉菌毒素多功能净化柱净化，氮气吹干，用１ｍＬ乙腈／水（１：ｌ，ｖ／ｖ）定容后，进行液相色谱．串联质谱法测定，采用色谱保留时间和质谱碎片离子丰度比定性，外标法定量。采用正离子扫描和负离子扫描的方式进行仪器方法学研究，确定丰度比最高的２对离子作为监测离子，进行ＭＲＭ模式定性定量分析。本方法的检出限（ＬＯＤ）为０．１～０．８斗ｇ／ｋｇ；线性范围为２．０—２００．０∥Ｌ，相关系数ｒ均大于０．９９９。在５．０～１００彬ｋｇ的添加水平上，上述１４种霉菌毒素及其类似物的平均回收率为５９．Ｏ％一１０７％；相对标准偏差为２．１％～１２．６％。关键词液相色谱一串联质谱法；饲料；玉米赤霉烯酮；黄曲霉毒素；单端孢霉烯族Ａ类毒索１引言霉菌毒素（Ｍｙｃｏｔｏｘｉｎｓ），又称真菌毒素，是某些霉菌在生长繁殖过程中产生的二次代谢有毒产物。霉菌毒素按产毒素的菌种主要可分为曲霉菌毒素（如黄曲霉毒素、赭曲霉毒素、杂色曲霉毒素等）、镰刀菌毒素（如脱氧雪腐镰刀菌烯醇类、玉米赤霉烯酮、Ｔ－２毒素、ＨＴ－２毒素等；青霉菌毒素，如桔青霉素、疣孢漆斑菌）等几大类。霉菌毒素污染对饲料造成严重的危害，主要表现为致癌性、遗传毒性、致畸性，类激素中毒和白细胞缺乏症等。在所有霉菌毒素中，黄曲霉毒素Ｂ．的毒性、致癌性、污染频率均居首位，是已知毒性最强的天然物质之一，已被国际卫生组织国际癌症研究总署（ＩＡＲＣ）确认为Ａ类致癌物质…。玉米赤霉烯酮有类似雌激素作用。霉菌毒素给畜牧业发展和畜产品安全造成极大危害【２Ｊ。目前，对畜牧业生产影响较大的霉菌毒素包括黄曲霉毒素、单端苞霉烯族和玉米赤霉烯酮等，而其中的每种毒素又有很多种存在形式，如黄曲霉毒素就包括Ｂ。，Ｂ：，Ｇ，，Ｇ：，Ｍ。，Ｍ：等多种形式存在，其限量允许值通常低于１５ｌ山ｇ／ｋｇ【３Ｊ。目前，检测这些毒素多采用酶联免疫（ＥＬＩＳＡ）法ＨＪ、薄层色谱（ＴＬＣ）法”１和液相色谱（ＨＰＬＣ）法∞１等，这些方法虽然在一定程度上解决了霉菌毒素的检测方法问题，但由于无法对样品进行准确的定性和定量分析，且容易出现假阳性等问题，不能作为最终的确证方法。为解决这些问题，迫切需要研究饲料中霉菌毒素的定性定量测定方法，如气相色谱一质谱（ＧＣ—ＭＳ）法…和液相色谱．串联质谱（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）法口’８叫２｜，其中ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ法集高效分离和多组分定性与定量于一体，成为近年来研究霉菌毒素检测的主要方向。本研究建立了三大类霉菌毒素及其类似物的同时检测方法，对样品前处理方法和仪器分析条件进行了系统优化，得到了满意的结果。２实验部分２．１仪器与试剂ＷａｔｅｒｓＡｌｌｉａｎｃｅ２６９５液相色谱仪，ＭｉｃｒｏｍａｓｓＱｕａｔｔｒｏＭｉｃｒｏ串联质谱仪（Ｗａｔｅｒｓ公司），配ＭａｓｓＬｙｎｘＶ４．１软件；３ｋ３０型冷冻离心机（Ｓｉｇｍａ公司）；ＭＳ３ｍｉｎｉｓｈａｋｅｒ旋涡混匀器（ＩＫＡ公司）；ＸＳ－２０５电子天平（Ｍｅｔｔｌｅｒ公司）；１２位水浴型氮吹仪（美国Ｏｒｇａｎｏｍａｔｉｏｎ公司）；２０通道固相萃取装置（Ｗａｔｅｒｓ公司）；ＴＣ—Ｍ１６０多功能净化柱（美国Ｔｒｉｌｏｇｙ公司）。２０１０－０２－２３收稿；２０１０－０７－０６接受?Ｅ—ｍａｉｌ：ｚｊｘｍ＿ｃｈｈ＠１６３．ｃｏｍ万方数据１７６０分析化学第３８卷ｍＬ标准品信息见表ｌ。取适量标准品，用甲醇配制成１１３０ｍｓ／Ｌ储备液，于一２０℃保存。１．０１０ｍｇ／Ｌ黄曲霉毒素Ｍ。和Ｍ：的标准溶液；５．０ｍＬ１００ｍｇ／ＬＴ－２毒素与ＨＴ－２毒素混合标准溶液。乙腈（色谱纯，美国Ｍｅｒｃｋ公司）；其它试剂均为分析纯；实验用水为Ｍｉｌｌｉ—Ｑ超纯水。分别吸取适量储备溶液（标准溶液）于同一容量瓶中，用甲醇配制成１．０ｍｓ／Ｌ混合标准中间液，于４℃保存。吸取适量上述混合标准中间液，用乙腈一水（１：ｌ，ＷＶ）配制成不同浓度的标准系列工作液。表１Ｔａｂｌｅｌ霉菌毒素及其类似物标准品列表Ｓｔａｎｄａｒｄｃｏｍｐｏｕｎｄｏｆ１４ｍｙｃｏｔｏｘｉｎｓａｎｄａｎａｌｏｇｕｅｓ２．２样品前处理２称取（５４－０．０２）ｇ试样于５０ｍＬ离心管中，加入２５ｍＬ乙腈一水（８４：１６，Ｖ／Ｖ）进行提取，涡旋混匀ｍｉｎ，置超声波清洗器中超声提取２０ｒａｉｎ，期间振荡２—３次；取出，以８０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｒａｉｎ，倾出上取ＴＣ．Ｍ１６０多功能净化柱，置固相萃取装置上，准确量取下层溶液５．００ｍＬ，控制流速为２ｍＬ／ｍｉｎ清液至分液漏斗中，加１５ｍＬ正己烷脱脂，待静止分层后，取下层溶液备用。左右，抽干，收集流出液，在６０℃下氮气吹干。用１．０ｍＬ乙腈一水（１：１，Ｖ／Ｖ）溶解残渣，涡旋３０Ｓ，经０．２２“ｍ滤膜过滤，待测。２．３色谱－质谱条件ＷａｔｅｒｓＡｔｌａｎｔｉｓｄＣｌ８柱色谱柱（１５０ｆｉｌｍ×３．０ｍｉｌｌ，３．０斗ｍ），柱温３３℃，进样量２０斗Ｌ。ＥＳＩ＋与ＥＳＩ一模式流动相的流速分别为０．２５和０．３０ｍＬ／ｍｉｎ，洗脱梯度条件见表２。电喷雾离子源（ＥＳＩ），离子源温度１２０℃，脱溶剂温度３８０℃，脱溶剂气和锥孔气均为Ｎ：，其中脱溶剂流速为５５０Ｌ／ｈ，锥孔气流速为５０Ｌ／ｈ，光电倍增器电压６５０Ｖ。黄曲霉毒素和单端孢霉烯族Ａ类毒素采用正离子监测方式，毛细管电压３．０ｋＶ，萃取电压２Ｖ；玉米赤霉烯酮采用负离子监测方式，毛细管电压为３．０ｋＶ，萃取电压２（Ｑ３）离子对均设为单位分辨，各离子对的驻留时间（Ｄｗｅｌｌｔｉｍｅ）均为１００ｍｓ，具体见表３。表２两种监测模式下的流动相组成及配比Ｔａｂｌｅ２ＧｒａｄｉｅｎｔｍｏｂｉｌｅｐｈａｓｅｆｏｒＨＰＬＣＶ。碰撞气为高纯氩气，控制碰撞室压力为３００Ｐａ。采用ＭＲＭ多反应监测方式。母离子（Ｑ１）／子离子万方数据第１２期表３应永飞等：液相色谱－串联质谱法测定饲料中１４种霉菌毒素及其类似物ＭＲＭ监测模式下１４种霉菌毒素及其类似物的质谱优化条件ＭＲＭｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｏｆａｎａｂｏｌｉｃｈｏｒｍｏｎｅｓｉｎＥＳＩ＋ｍｏｄｅａｎｄＥＳＩ—ｍｏｄｅＴａｂｌｅ３女为定量子离子（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎｉｏｎ）。３结果与讨论３．１质谱条件的优化玉米赤霉烯酮、黄曲霉毒素和单端孢霉烯族Ａ类毒素属于脂溶性化合物，极性较弱。文献［１０］曾采用大气压化学电离（ＡＰＣＩ）作为离子源，但电喷雾电离（ＥＳＩ）离子源更易操作和维护，已成为测定霉菌毒素的主要方法。以乙腈一水（５０：５０，Ｖ／Ｖ）为流动相，采用“Ｔ”三通方式，对１４种霉菌毒素的质谱条件进行优化，在正离子和负离子模式下进行全扫描，以选择合适的准分子离子峰和电离方式。根据不同化合物的响应和保留时间差异，设置了不同的监测模式，其中黄曲霉毒素和单端孢霉烯族Ａ类毒素的准分子离子为正电离模式下获得的［Ｍ＋Ｈ］＋；玉米赤霉烯酮因含有酚羟基结构，其准分子离子峰为负电离模式下获得的［Ｍ—Ｈ］一。结合基质空白和基质标准液的离子扫描图，优化参数，确定了各种激素在多反应监测模式下信号采集的特征离子对（表３）。离子丰度比满足欧盟２００２／６５７／ＥＣ决议要求【１３Ｊ。图１为ＭＲＭ监测模式下猪饲料基质中霉菌毒素标准溶液的选择离子流图。３．２液相色谱条件的优化在完成了质谱条件的优化后，需考察液相色谱的分离条件。由于电喷雾质谱的电离是在溶液状态电离，因此流动相的组成和配比不但影响目标化合物的色谱行为，还会影响目标化合物的离子化效率，从而影响灵敏度。以ＷａｔｅｒｓｄＣｌ８柱（１５０Ｉｎｎｌ×２．１ｓｙｍｍｅｔｒｙＣ１８柱（１５０ｍｍ×２．１ｍｍ，３．５“ｍ，Ｗａｔｅｒｓ公司）和ＷａｔｅｒｓＡｔｌａｎｔｉｓｍｍ，３．０ｐｍ，Ｗａｔｅｒｓ公司）为分离柱，在正离子模式下，流动相中加入Ｏ．１％甲酸；在负离子模式下，流动相中加入０．０２％乙酸，均有利于化合物的离子化。采用正离子模式监测黄曲霉毒素和单端孢霉烯族Ａ类毒素，采用负离子模式监测玉米赤霉烯酮类，比较了两种色谱柱的分离效果，发现都能将被测药物与杂质较好的分离开，而Ｗａｔｅｒｓ３．３样品前处理方法的确定目前，霉菌毒素的提取方法主要以甲醇、乙腈及它们与水的混合溶液为提取剂。本研究在参考文献［２］的基础上，比较了８０％，８４％，８６％，９０％（Ｖ／Ｖ）的乙腈一水溶液的提取效率，并对提取方法、提取时间等条件进行了研究，确定最佳条件。实验表明，８４％（∥ｙ）乙腈－水溶液对各霉菌毒素的提取效果总体效果最佳，选择作为提取液。固相萃取净化方法是复杂基质中痕量检测进行净化的常用方法。本研究对不同净化柱（ＲｏｍｅｒＡｔｌａｎｔｉｓｄＣ。。柱比ＷａｔｅｒｓｓｙｍｍｅｔｒｙＣ。８柱的柱效果更佳，因此选用前者作为分离柱。经过优化，分别确定了流动相比例和梯度条件，具体见表２。万方数据１７６２分析化学第３８卷１０ＭＲＭ１１ｏｆ９Ｃｈａｎｎｅｌｓ１２ＥＳ卜１３．１４１５Ｏｎ坨１．Ｏ矿Ｖ▲¨Ｉ＝可▲眩｜一可Ｉ＝丁∥１０ＭＲＭ１Ｉｏｆ９ＣｈａｎｎｅｌｓＥＳ！一１２１３ｆ１４１５ｔ＿Ｏ４Ｍ８９１ＲＭ＞ｏｆ２４１５６；ｈ毗鳓＋１０ＭＲＭｌｌ１２１３１４１５．ｈｏｆ１６ＣｈａｎｎｅｌｓＥＳＩ＋ｇ．ｔ＿Ｏ．！．竺…一一一一一…一一▲一一１６１７１．Ｏ４４６８＞３４５１１０二竺竺一一一一一一一一▲一一，一．．１３ｌｌ１２１４１５１６１７ｔ／ｍｉｎｌ＿Ｏ～一～一：一～一～一世～图１Ｆｉｇ．１ＭＲＭ监测模式下猪饲料基质中霉菌毒素标准溶液的选择离子流图（５０ｇ／Ｌ）ＳｅｌｅｃｔｅｄｉｏｎｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｏｆｓｔａｎｄａｒｄｓｉｎＭＲＭｏｆＭｙｃｏｔｏｘｉｎｓｉｎＳｗｉｎｅ’ｓｆｅｅｄａ．ｆｌ－ＺＡＬ；ｂ．ａ－ＺＡＬ；Ｃ．卢一ＺＥＬ；ｄ．ａ－ＺＥＬ；ｅ．ＺＡＮ；ｆ．ＺＥＮ；ｇ．Ｔ－２；ｈ．ＨＴ－２；ｉ．ＡＦＧ２；ｊ．ＡＦＧＩ；ｋ．ＡＦＭ２；１．ＡＦＭＩ；ｍ．ＡＦＢ２；ｎ．ＡＦＢＩ．ＭｕｌｔｉｏｇｙＳｅｐ＠２２６型清洗柱（５ｍＬ，Ｒｏｍｅｒ公司）、ＲｏｍｅｒＭｙｃｏＳｅｐ＠２２６型清洗柱（５ｍＬ，Ｒｏｍｅｒ公司）、Ｔｒｉｌ．ＴＣ－Ｍ１６０多功能净化柱和ＷａｔｅｒｓＨＬＢ柱（５００ｒａｇ／６ｍＬ，Ｗａｔｅｒｓ公司））的净化效果进行了比较，根据各自的性能和厂家提供的方法优化了条件。实验表明，ＨＬＢ作为反相保留行为的净化柱，在净化黄曲霉毒素时具有良好的色谱保留，回收率较稳定，但玉米赤霉烯酮类霉菌毒素的回收率稳定性较差，同时洗脱液较脏，无法准确定量。采用多功能净化柱得到了较为满意的净化效果，但由于是多种毒素同时检测，ＭｕｌｔｉＳｅＰ＠２２６和ＭｙｃｏＳｅｐ＠２２６对玉米赤霉烯酮类霉菌毒素的回收率稳定性稍差，相对而言，ＴＣ—Ｍ１６０更加稳定。因此，本研究选择ＴＣ．Ｍ１６０作为方法学研究的净化柱。３．４方法的线性方程和检出限配制与检测样品相同基质的混合标准系列工作液，浓度为２．０，４．０，１０．０，２０．０，５０．０，２００ｕｇ／Ｌ。分别以选定的定量离子峰面积与内标物峰面积的比值），对浓度戈（斗ｇ／Ｌ）绘制标准曲线，１４种霉菌毒素及其类似物浓度在２．０Ｌ一２００．０¨ｇ／Ｌ范围内呈良好的线性关系，ｒ均大于０．９９９。采用空白样品中添加目标化合物的方法，按样品处理方法进行处理和检测，以３倍信噪比为检出限（ＬＯＤ）。１４种霉菌毒素及其类似物的线性方程及ＬＯＤ见表４。表４１４种霉菌毒素及其类似物的线性方程、相关系数和检出限（ｎ＝６）Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎｃｕｒｖｅｓ，ｃｏｒｅｌａｔｉｏｎｃｏｅｆｆｉｅｎｔａｎｄＬＯＤｏｆ１４ｍｙｃｏｔｏｘｉｎｓａｎｄＴａｂｌｅ４ａｎａｌｏｇｕｅｓ（ｎ＝６）线性方程Ｃｕ“ｅｒ逃合物。Ｃ。”ｐｏ““ｄＡＦＢｌＡＦＢ，ＡＦＧｌＡＦＧ２ＡＦＭＩＡＦＭ２ｌｉＴ－２线性方程ＣｕＨｅｒ相拳蚕数（７）０．９９９９０．９９９８０．９９９５０．９９９９０．９９９７肆出Ｉ璺（∥ＬＵＬｋ／ｇ）０．３０．３０．３０．５蔗合物，ｃ“ｐｏ““ｄＴ－２ＺＥＮＺＡＮａ．ＺＥＬ相拳蚕数（ｒ）０．９９９４０．９９９９０．９９９６０．９９９５０．９９９３埠ｇ操（斗Ｌｇ／ＵＵｋｇ）０．１ｙ＝１２６．８ｘ＋５５．９３Ｙ＝２０６．７ｘ＋８０９．９Ｙ＝１３．３２ｘ一２．０１１Ｙ＝４９．８５ｘ＋４９．５５Ｙ＝２３．１５ｘ一２．３１５ｙ＝２５．０２ｘ一１０．２５Ｙ＝２５．８３ｘ＋７．０２０Ｙ＝４５．１６ｘ＋１４．２０ｙ＝４５．７２ｘ＋８６．７６ｙ＝１２８．６ｚ＋２７５．９ｙ＝５０．９９ｘ＋８７．４８ｙ＝４７．５５ｘ＋５６．９００．８０．８０．８０．８０．８０．８０．３０．５０．１口－ＺＥＬａ．ＺＡＬｙ＝３３．２５ｘ—１２．０５ｖ＝１８７．２２ｘ＋２５．９３０．９９９７０．９９９２０．９９９６０．９９９０口．ＺＡＬ３．５回收率实验取同一批号的空白鸡饲料和猪饲料样品，加适量混合标准工作液，使加标量为５．０—１００ｔｑｓ／ｋｓ，按“２．３”项下的方法处理后进行分析。每个浓度点取５份样品，求其平均回收率，并计算批内相对标准偏差，结果详见表５。万方数据