第八章 菌种的保藏

要点： 菌种的衰退：菌种衰退的现象可表现在形态上或生理上。其主要原因是基因突变，连续传代 和采用不适宜的培养和保藏条件也可加速菌种的衰退。为防止菌种衰退可采取一些措 施，如控制传代次数、创造良好的培养条件、利用不同类型的细胞移种传代、采用有 效的菌种保藏方法、讲究菌种选育技术及定期进行分离纯化等。 菌种的复壮：从已衰退的菌种中筛选出少数尚未退化的个体，以达到恢复原菌株固有性状的 方法是一种“狭义的复壮”，目前较提倡的是被称为“广义复壮”的一种积极措施， 即在菌种的典型特征或生产性状尚未衰退前，就经常有意识地采取纯种分离和生产性 状测定工作，以期从中选择到自发的正突变个体。菌种复壮常用方法有：纯种分离法、 宿主体内复壮法、淘汰法和遗传育种法。 菌种的保藏：菌种保藏的目的是尽可能保持菌种原有性状和活力的稳定，使其不死、不变、 不被污染，以提供给科研、生产和实验的需要。为防止突变，保持纯种，最主要的保 藏措施是干燥、低温、缺氧、避光、缺乏营养、添加保护剂等。保藏菌种的方法有： 斜面低温保藏法、石蜡油封藏法、砂土管保藏法、麸皮保藏法、甘油悬液保藏法、冷 冻真空干燥保藏法、液氮超低温保藏法和宿主保藏法等。

第一节 菌种的衰退和复壮

在微生物的基础研究和应用研究中，选育一株理想的菌株是一件艰苦的工作，而欲使菌种始终保持优良性状的遗传稳定性，便于长期使用，还需要做很多日常的工作。实际上，由于各种各样的原因，要使菌种永远不变是不可能的，菌种衰退是一种潜在的威胁。只有掌握了菌种衰退的某些规律，才能采取相应的措施，尽量减少菌种的衰退或使已衰退的菌种得以复壮。

一、菌种的衰退

（一）菌种衰退的现象

菌种衰退（degeneration）是指由于自发突变的结果，而使某物种原有的一系列生物学性状发生量变或质变的现象。菌种衰退的具体表现有以下几个方面：

1. 菌落和细胞形态改变。每一种微生物在一定的培养条件下都有一定的形态特征，如果典型的形态特征逐渐减少，就表现为衰退。例如，泾阳链霉菌“5406”的菌落原来为凸形变成了扇形、帽形或小山形；孢子丝由原来螺旋形变成波曲形或直形，孢子从椭圆形变成圆柱形等。

2. 生长速度缓慢，产孢子越来越少。例如，“5406”的菌苔变薄，生长缓慢(半个月以上才长出菌落)，不产生丰富的桔红色的孢子层，有时甚至只长些黄绿色的基内菌丝。

3. 代谢产物生产能力的下降，即出现负突变。例如，黑曲霉糖化力、放线菌抗生素发酵单位的下降以及各种发酵代谢产物量的减少等，在生产上是十分不利的。

4. 致病菌对宿主侵染能力下降。如白僵菌对宿主致病能力的降低等。

5. 对外界不良条件（包括低温、高温或噬菌体侵染等）抵抗能力的下降等。如抗噬菌体菌株变为敏感菌株等。

值得指出的是，有时培养条件的改变或杂菌污染等原因会造成菌种衰退的假象，因此在实践工作中一定要正确判断菌种是否退化，这样才能找出正确的解决办法。

（二）菌种衰退的原因

菌种衰退不是突然发生的，而是从量变到质变的逐步演变过程。开始时，在群体细胞中仅有个别细胞发生自发突变（一般均为负变），不会使群体菌株性能发生改变。经过连续传代，群体中的负变个体达到一定数量，发展成为优势群体，从而使整个群体表现为严重的衰退。经分析发现，导致这一现象的原因有以下几方面。

1. 基因突变

（1）有关基因发生负突变导致菌种衰退 菌种衰退的主要原因是有关基因的负突变。如果控制产量的基因发生负突变，则表现为产量下降；如果控制孢子生成的基因发生负突变，则产生孢子的能力下降。菌种在移种传代过程中会发生自发突变。虽然自发突变的几率很低(一般为10-6～10-9)，尤其是对于某一特定基因来说，突变频率更低。但是由于微生物具有极高的代谢繁殖能力，随着传代次数增加，衰退细胞的数目就会不断增加，在数量上逐渐占优势，最终成为一株衰退了的菌株。

（2）表型延迟造成菌种衰退

表型延迟现象也会造成菌种衰退。如，在诱变育种过程中，经常会发现某菌株初筛时产量较高，进行复筛时产量却下降了。

（3）质粒脱落导致菌种衰退

质粒脱落导致菌种衰退的情况在抗生素生产中较多，不少抗生素的合成是受质粒控制的。当菌株细胞由于自发突变或外界条件影响（如高温），致使控制产量的质粒脱落或者核内DNA和质粒复制不一致，即DNA复制速度超过质粒，经多次传代后，某些细胞中就不具有对产量起决定作用的质粒，这类细胞数量不断提高达到优势，则菌种表现为衰退。

2. 连续传代

连续传代是加速菌种衰退的一个重要原因。一方面，传代次数越多，发生自发突变（尤其是负突变）的几率越高；另一方面，传代次数越多，群体中个别的衰退型细胞数量增加并占据优势越快，致使群体表型出现衰退。

3. 不适宜的培养和保藏条件

不适宜的培养和保藏条件是加速菌种衰退的另一个重要原因。不良的培养条件如营养成分、温度、湿度、pH值、通气量等和保藏条件如营养、含水量、温度、氧气等，不仅会诱发衰退型细胞的出现，还会促进衰退细胞迅速繁殖，在数量上大大超过正常细胞，造成菌种衰退。

（三）菌种衰退的防止

根据菌种衰退原因的分析,可以制定出一些防治衰退的措施，主要从以下几方面考虑： 1. 控制传代次数

意即尽量避免不必要的移种和传代，将必要的传代降低到最低限度，以减少自发突变的机率。一套良好的菌种保藏方法可大大减少不必要的移种和传代次数。

2. 创造良好的培养条件

创造一个适合原种的良好培养条件，可以防止菌种衰退。如培养营养缺陷型菌株时应保证适当的营养成分，尤其是生长因子；培养一些抗性菌时应添加一定浓度的药物于培养基中,使回复的敏感型菌株的生长受到抑制，而生产菌能正常生长；控制好碳源、氮源等培养基成分和pH、温度等培养条件，使之有利于正常菌株生长，限制退化菌株的数量，防止衰退。例如，利用菟丝子的种子汁培养“鲁保一号”真菌可防止其退化；在赤霉素生产菌藤仓赤霉的培养基中，加入糖蜜、天冬酰胺，谷氨酰胺、5－核苷酸或甘露醇等丰富营养物时，也有防止菌种衰退的效果；此外，将培养栖土曲霉(Aspergillus terricola)3.942的温度从28～30℃提高到33～34℃，可防止其产孢子能力的衰退。

3. 利用不易衰退的细胞移种传代

在放线菌和霉菌中，由于它们的菌丝细胞常含几个细胞核，甚至是异核体，因此用菌丝接种就会出现不纯和衰退，而孢子一般是单核的，用它接种时，就不会发生这种现象。在实践中，若用灭过菌的棉团轻巧地对放线菌进行斜面移种，由于避免了菌丝的接入，因而达到了防止衰退的效果；另外，有些霉菌（如构巢曲霉）若用其分生孢子传代就易衰退，而改用子囊孢子移种则能避免衰退。

4. 采用有效的菌种保藏方法

有效的菌种保藏方法是防止菌种衰退极其必要的措施。在实践中，应当有针对性的选择菌种保藏的方法。例如，啤酒酿造中常用的酿酒酵母，保持其优良发酵性能最有效的保藏方法是－70℃低温保藏，其次是4℃低温保藏，若采用对于绝大多数微生物保藏效果很好的冷冻干燥保藏法和液氮保藏法，其效果并不理想。

一般斜面冰箱保藏法只适用于短期保藏，而需要长期保藏的菌种，应当采用砂土保藏法、冷冻干燥保藏法及液氮保藏法等方法。对于比较重要的菌种，尽可能采用多种保藏方法。

工业生产用菌种的主要性状都属于数量性状，而这类性状恰是最易衰退的。即使在较好的保藏条件下，还是存在这种情况。例如链霉素产生菌——灰色链霉菌的菌种保藏即使是用冷冻干燥保藏法等现今较好的方法，还是会出现这类情况。由此说明有必要研究和采用更有效的保藏方法以防止菌种的衰退。

5. 讲究菌种选育技术 在菌种选育时，应尽量使用单核细胞或孢子，并采用较高剂量使单链突变而使另一单链丧失作为模板的能力,避免表型延迟现象。同时，在诱变处理后应进行充分的后培养及分离纯化，以保证菌种的纯度。

6. 定期进行分离纯化

定期进行分离纯化，对相应指标进行检查，也是有效防止菌种衰退的方法。此方法将在菌种复壮部分介绍。

二、菌种的复壮

（一）复壮

从菌种衰退的本质可以看出，通常在已衰退的菌种中存在有一定数量尚未衰退的个体。 狭义的复壮是指在菌种已经发生衰退的情况下，通过纯种分离和测定典型性状、生产性能等指标，从已衰退的群体中筛选出少数尚未退化的个体，以达到恢复原菌株固有性状的相应措施。

广义的复壮是指在菌种的典型特征或生产性状尚未衰退前，就经常有意识地采取纯种分离和生产性状测定工作，以期从中选择到自发的正突变个体。

由此可见，狭义的复壮是一种消极的措施，而广义的复壮是一种积极的措施，也是目前工业生产中积极提倡的措施。

（二）菌种复壮的主要方法 1. 纯种分离法

通过纯种分离,可将衰退菌种细胞群体中一部分仍保持原有典型性状的单细胞分离出来,经扩大培养,就可恢复原菌株的典型性状。常用的分离纯化的方法可归纳成两类：一类较粗放，只能达到“菌落纯”的水平，即从种的水平来说是纯的。例如采用稀释平板法、涂布平板法、平板划线法等方法获得单菌落。另一类是较精细的单细胞或单孢子分离方法。它可以达到“细胞纯”即“菌株纯”的水平。后一类方法应用较广，种类很多，既有简单的利用培养皿或凹玻片等作分离室的方法，也有利用复杂的显微操纵器的纯种分离方法。对于不长孢子的丝状菌，则可用无菌小刀切取菌落边缘的菌丝尖端进行分离移植，也可用无菌毛细管截

取菌丝尖端单细胞进行纯种分离。

2. 宿主体内复壮法

对于寄生性微生物的衰退菌株，可通过接种到相应昆虫或动植物宿主体内来提高菌株的毒性。例如，苏云金芽孢杆菌经过长期人工培养会发生毒力减退、杀虫率降低等现象，可用退化的菌株去感染菜青虫的幼虫，然后再从病死的虫体内重新分离典型菌株。如此反复多次，就可提高菌株的杀虫率。根瘤菌属经人工移接,结瘤固氮能力减退,将其回接到相应豆科宿主植物上,令其侵染结瘤,再从根瘤中分离出根瘤菌,其结瘤固氮性能就可恢复甚至提高。

3. 淘汰法

将衰退菌种进行一定的处理（如药物，低温、高温等），往往可以起到淘汰已衰退个体而达到复壮的目的。如有人曾将“5406”的分生孢子在低温(－10～30℃)下处理5～7d，使其死亡率达到80％，结果发现在抗低温的存活个体中留下了未退化的健壮个体。

4. 遗传育种法 即把退化的菌种，重新进行遗传育种，从中再选出高产而不易退化的稳定性较好的生产菌种。

第二节 菌种的保藏

菌种是重要生物资源，研究和选择良好的菌种保藏方法具有重要的意义。

一、菌种保藏的目的

微生物在使用和传代过程中容易发生污染、变异甚至死亡，因而常常造成菌种的衰退，并有可能使优良菌种丢失。菌种保藏的重要意义就在于尽可能保持其原有性状和活力的稳定，确保菌种不死亡、不变异、不被污染，以达到便于研究、交换和使用等诸方面的需要。

菌种保藏对于基础研究和实际生产具有特别重要的意义。在基础研究中，菌种保藏可以保证研究结果获得良好的重复性。对于实际应用的生产菌种，可靠的保藏措施可以保证优良菌种长期高产稳产。

二、菌种保藏的原理

无论采用何种保藏方法，首先应该挑选典型菌种的优良纯种来进行保藏，最好保藏它们的休眠体，如分生孢子、芽孢等。其次，应根据微生物生理、生化特点，人为地创造环境条件，使微生物长期处于代谢不活泼、生长繁殖受抑制的休眠状态。这些人工造成的环境主要是干燥、低温和缺氧，另外，避光、缺乏营养、添加保护剂或酸度中和剂也能有效提高保藏效果。

水分对生化反应和一切生命活动至关重要，因此，干燥尤其是深度干燥，在菌种保藏中占有首要地位。五氧化二磷、无水氯化钙和硅胶是良好的干燥剂，当然，高度真空则可以同时达到驱氧和深度干燥的双重目的。

低温是菌种保藏中的另一重要条件。微生物生长的温度下限约在-30℃，可是在水溶液中能进行酶促反应的温度下限则在-140℃左右。这可能就是即使把微生物保藏在较低的温度下，但只要有水分存在，还是难以较长期地保藏它们的一个主要原因。因此，低温必须与干燥结合，才具有良好的保藏效果。在低温保藏中，细胞体积较大者一般要比较小者对低温敏感，而无细胞壁者则比有细胞壁者敏感。其原因是低温会使细胞内的水分形成冰晶，从而引起细胞结构尤其是细胞膜的损伤。如果放到低温-70℃下进行冷冻时，适当采用速冻的方法，可使产生的冰晶小而减少对细胞的损伤。当从低温下移出并开始升温时，冰晶又会长大，故