能谱分析结果显示,与图3.17(A)相比, PSNs;B:钙离子PSNS)
B:PSNswithionizedealcium)
图3.17(B)中有明显的ca2+峰,说明新型无机纳米载体的构建及其药物/基因的高效传递研究
钙离子有效结合到多孔二氧化硅纳米粒上\图3.18钙离子化DNA一PSNS电泳图
F193#18EleetroPhoretogramofDNA一PSNswithionizedealeium
琼脂糖电泳结果表明:钙离子化的PSNS能够与质粒DNA较好的结合,阻
滞其电泳迁移,而未修饰的PSNS与DNA结合能力弱,不能有效阻滞DNA迁移 (图3.18)\滞 葬墨扭 黔 参
材娜{滋蠢爹笼界 AB
图3.19DNA一PSNS(A)和钙离子化DNA一PSNS(B)转染干细胞图 F193.19ImagesofMSCstransfectedbyDNA一PSNs(A)andDNA一PSNswithionizedealeit,m(B)
干细胞转染结果表明:与DNA一PSNS相比,钙离子化DNA一PSNS能够转染 更多的细胞(图325),说明钙离子化DNA一PSNS可以作为一种有效的非病毒基 因载体\4小结
4.1oNA一磷酸钙纳米粒的制备及其干细胞的传递研究
用反相微乳法制备了pTGF一pl一磷酸钙纳米粒,对其进行表征,并将其应用于 十细胞的转染\研究结果表明:DNA一磷酸钙纳米粒的粒径为20一50nnl;琼脂糖
电泳结果表明:磷酸钙:质粒质量比为2:1时,磷酸钙纳米粒携带质粒很最大,江苏大学博士学位论文
可有效阻滞DNA的迁移;活细胞工作站测定结果显示:游离DNA因没有纳米 粒载体的作用,细胞未染色,说明游离DNA未进入细胞内,而DNA一磷酸钙纳 米粒Zh开始有少数细胞被染色,随着时间的推移,越来越多的外源基因进入细 胞,说明纳米粒可有效携带基因进入细胞;激光共聚焦显微镜观察核转运结果显 示:Zh未见细胞核内染成红色,说明DNA一磷酸钙纳米粒此时尚未进入细胞核, 4h进核亦不明显,sh有少量进核,18h可见细胞核内呈明显的红色,表明此时 外源DNA在纳米粒作用下进核明显;活细胞工作站和共聚焦显微镜测定结果均 显示纳米粒可被干细胞吞噬\法测定细胞毒性,结果显示:DNA一磷酸钙 纳米粒的毒性明显低于市售转染试剂Lipofectamine20oo(P<0.01);ELIsA测定 结果表明,DNA一磷酸钙在干细胞中的转染效果与转染试剂LipofectamineZ000相 当(P>0.05),显著高于磷酸钙转染试剂盒(P<0.01)\为进一步考察用细胞外
基质修饰前后DNA一磷酸钙纳米粒的核转运情况,采用精氨酸一甘氨酸一天冬氨酸 (a笔inine一glyeine一aspartieacid,RGD)!纤维粘结蛋白(fibroneetin,FN)!层勃 蛋白(lalninin,LN)修饰DNA一磷酸钙纳米粒,观察RGD竞争抑制前后的基因 在细胞内转运分布情况:取转染sh后的干细胞固定,激光共聚焦显微镜观察结
果显示,RGD修饰DNA一磷酸钙纳米粒进核不明显,DNA一磷酸钙纳米粒可见核 中有红色亮点,说明有少量进核;FN及LN修饰DNA一磷酸钙纳米粒8h可见细 胞核内呈明显的红色,表明此时外源DNA进核作用明显;说明FN或LN修饰
的DNA一磷酸钙纳米粒与未修饰的DNA一磷酸钙纳米粒相比,修饰后的DNA一磷 酸钙纳米粒能更快!更多的进入细胞核内\实验研究结果表明:DNA一磷酸钙纳 米粒转染效率高!毒性低,可以作为一种生物安全的非病毒基因载体\4.2多糖修饰的DNA--磷酸钙纳米粒的制备及其干细胞的传递研究
选择DNA一磷酸钙纳米粒,通过对载基因纳米粒进行修饰,成功制备了多糖
修饰的DNA一磷酸钙纳米粒,初步研究了多糖修饰的DNA一磷酸钙纳米粒在干细 胞中的转运情况\透射电镜测定结果表明:多糖修饰的DNA一磷酸钙纳米粒呈球 型!粒径分布稳定!分散均一,粒径在50nm左右;ELISA测定结果表明:与市
售脂质体lipofe以amineZO00相比,多糖修饰的DNA一磷酸钙纳米粒在干细胞中具 有更高的转染效率\
4.3钙离子化ONA一多孔二氧化硅纳米粒的制备及其性能评价新型无机纳米载体的构建及其药物冻因的高效传递研究
选择DNA一多孔二氧化硅纳米粒,通过对其进行修饰,成功制备了钙离子化
DNA一多孔二氧化硅纳米粒,初步研究了钙离子化DNA一多孔二氧化硅纳米粒在 干细胞中的转运\琼脂糖电泳结果表明:钙离子化的多孔二氧化硅纳米粒能够与 质粒DNA较好的结合,阻滞其电泳迁移,而未修饰的多孔二氧化硅纳米粒与 DNA结合能力弱,不能有效阻滞DNA迁移;EDS能谱分析结果表明:钙离子
有效结合到多孔二氧化硅纳米粒上;倒置荧光显微结果表明:与DNA一多孔二氧 化硅纳米粒相比,钙离子化DNA一多孔二氧化硅纳米粒能够转染更多的细胞,说 明钙离子化DNA一多孔二氧化硅纳米粒可以作为一种有效的非病毒基因载体\基因治疗已显示出巨大的应用潜力,尤其是非病毒基因载体系统更是国内外 医学领域追踪的热点\纳米无机材料是近年来作为非病毒性基因载体的又一新的 尝试\非病毒性载体一般不会造成基因的永久性表达,无抗原性!体内应用安全; 另外组成明确,易大量制备,以及多样性的化学结构,使得研制新的更理想的载 体系统成为可能,故越来越受到青睐\江苏大学博士学位论文 第四章三维纳米基因传递系统的构建及其在干细胞诱导分 化中的应用研究
目前,包括细胞或组织工程复合移植在内的新技术正在应用于骨或软骨的损 伤修复,种子细胞的选择是组织工程的核心问题之一\干细胞因其突出的优点, 己经被越来越多的研究者所青睐\研究证实,干细胞具有强大的多能分化潜能, 它可以在特定的诱导条件下向软骨细胞!成骨细胞!神经细胞!心肌细胞!平滑 肌细胞等多个方向定向分化,是一种优秀的种子细胞=.08]\应用干细胞构建组织 工程软骨是较为理想的选择\研究认为,三维立体培养要优于平面培养[l00],能 够明显促进细胞的增殖\国外早有应用琼脂糖及其复合物作为支架材料来研究细 胞三维培养的报道,并且证实能够促进H型胶原和aggrecan的表达=.06]\本部分将细胞外基质修饰纳米粒制备技术与基于组织工程的三维支架技术
相结合,构建非病毒三维纳米基因传递系统(3一dimensionalnanoparticlesgene deliverysystem,3D一NGDS)\以细胞外基质(EeM)成分为支架材料,制备嵌 合有DNA一磷酸钙纳米粒的三维纳米支架,成功构建了兼具高效!缓释特征的 非病毒三维纳米基因传递系统\
1三维纳米基因传递系统的构建及其性能评价