第37讲 克隆技术

1．铁皮石斛是我国名贵中药，生物碱是其有效成分之一。应用组织培养技术培养铁皮石斛拟原球茎(简称PLBs，类似愈伤组织)生产生物碱的实验流程如下： 新生营养芽PLBsPLBs

在固体培养基上，PLBs的重量、生物碱含量随增殖培养时间的变化如图所示，请回答下列问题：

(1)选用新生营养芽为外植体的原因是，诱导外植体形成PLBs的过程称。 (2)与黑暗条件下相比，PLBs在光照条件下生长的优势体现在，，。

(3)脱落酸(ABA)能提高生物碱含量，但会抑制PLBs的生长。若采用液体培养，推测添加适量的ABA可提高生物碱产量。同学们拟开展探究实验验证该推测，在设计实验方案时探讨了以下问题：

①ABA的浓度梯度设置和添加方式：设4个ABA处理组，1个空白对照组，3次重复。因ABA受热易分解，故一定浓度的无菌ABA母液应在各组液体培养基后按比例加入。

②实验进程和取样：实验50天完成，每10天取样，将样品(PLBs)称重(g/瓶)后再测定生物碱含量。如初始(第0天)数据已知，实验过程中还需测定的样品数为。

③依所测定数据确定适宜的ABA浓度和培养时间：当某3个样品(重复样)的时，其对应的ABA浓度为适宜浓度，对应的培养时间是适宜培养时间。 答案 (1)营养芽细胞分裂能力强，几乎不含病毒 脱分化

(2)开始增重的时间早 增重持续的时间长 PLBs增重的量更多 (3)①灭菌冷却 ②75 ③生物碱产量最高

解析 (1)选用新生营养芽为外植体是因为其分裂能力旺盛且几乎不携带病毒。诱导外植体形成类似愈伤组织的PLBs的过程称为脱分化。(2)分析曲线图可知，在光照条件下PLBs开始增重的时间早，增重持续的时间长，增重的量更多。(3)①ABA受热易分解，故一定浓度的无菌ABA母液应在各组液体培养基灭菌冷却后按比例加入。②据题意可知，该实验共设置4个实验组和1个对照组，共5组；实验50天完成，每10天取样，初始数据已知，只需测5次，故5组样品重复3次，共需测定的样品数为25×3＝75。③在适宜的ABA浓度和适宜的培养时间下，样品生物碱含量最高。

2．基因型为AaBb的水稻(24条染色体)的花药通过无菌操作，接入试管后，在一定条件下培养形成试管苗。据图回答下列问题：

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(1)愈伤组织是花粉细胞不断分裂后形成的不规则的细胞团，愈伤组织形成过程中，必须从培养基中获得和小分子有机物等营养物质。

(2)花药在培养基所提供的特定条件下发生多次细胞分裂，形成愈伤组织，此过程叫做，细胞分裂的方式是。

(3)诱导愈伤组织分化出芽和根，最后长成植株。这一过程叫。该植株是植株，其特点是，生产上没有推广应用的价值。

(4)要促进花粉细胞分裂生长，培养基中应有和两类激素。

(5)愈伤组织分化是指愈伤组织形成芽和茎。这一过程中必须给予光照，其原因是： ①。 ②。

(6)试管苗的细胞核中含有个DNA分子。

(7)培养成的试管苗可能出现的基因型有。如果要获得育种需要的植株，并能繁殖新品种，后面的育种步骤是。 答案 (1)水、无机盐 (2)脱分化 有丝分裂

(3)再分化 单倍体 长势弱小，高度不育

(4)生长素 细胞分裂素 (5)光是叶绿体形成的必要条件 光合作用需要光 (6)12

(7)ab、Ab、AB、aB 用秋水仙素处理单倍体幼苗

3．(2015·嘉兴模拟)美国科学家将胡萝卜韧皮部的细胞培养产生完整植株，如图所示。请据图回答下列问题。

(1)科学家所用的胡萝卜韧皮部的细胞，在正常生物体内能否进行有丝分裂？说明原因。 。

(2)韧皮部细胞通过和形成的许多植株的特点是。

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(3)此实验证明了高度分化的植物细胞仍具有发育成完整植株的能力，即具有，高度分化的细胞具有此特性是由于 。

(4)下表为几种组织培养的培养基配方的部分成分及培养条件和特点。 培养基作用 建立愈伤组织的培养基 糖类 大量元素 N、P、K、Ca、Mg、S等 微量元素 B、Cu、Mn、Mo、Cl、 Fe等 B、Cu、Mn、Mo、Cl、 Fe等 B、Cu、Mn、Mo、Cl、 Fe等 萘乙酸 18℃连续光照 － 15℃黑暗 2,4—D 25℃黑暗 植物激素 条件 蔗糖 培养根尖的培养基 蔗糖 N、P、K、Ca、Mg、S等 培养茎尖的培养基 蔗糖 N、P、K、Ca、Mg、S等 根据上表分析说明，组织培养的条件是 。

(5)试简要说明组织培养技术的优点以及这一技术在实践中的具体应用(举例)。 。

答案 (1)不能。因为植物韧皮部的细胞已经分化，在正常植物体内，不再分裂 (2)细胞分裂 细胞分化 彼此性状极为相似

(3)全能性 这些细胞最终由同一细胞(受精卵)经有丝分裂形成，细胞核中含有保持该物种遗传特性所需要的全套遗传物质

(4)组织培养的培养基中一般都含有能维持细胞正常生活的物质，如蔗糖、大量元素和微量元素等，不同功能的培养基中还含有不同的植物激素，同时因为培养的目的不同，培养的外界条件(光照和温度等)也不同

(5)①优点：取材少、培养周期短、繁殖率高，而且便于自动化管理。

②应用：快速繁殖花卉和果树，培育无病毒植物，生产药物、食品添加剂，制造人工种子等 解析 (1)在生物体内已经分化的细胞不再具有分裂能力。(2)(3)韧皮部细胞为胡萝卜体细胞，其细胞核内含有其生长发育所需要的全套遗传物质，遗传物质在特定时间和特定空间表达，从而形成许多植株。(4)在植物组织培养过程中，不同的营养条件，不同的植物激素对

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植物细胞的表达影响不同。(5)该项技术属于无性繁殖范畴，不但能保持亲本的优良性状，而且便于管理。

4．某研究小组进行药物试验时，以动物肝细胞为材料，测定药物对体外培养细胞的毒性。供培养的细胞有甲、乙两种，甲细胞为肝肿瘤细胞，乙细胞为正常肝细胞。 请回答下列有关动物细胞培养的问题：

(1)将数量相等的甲细胞和乙细胞分别置于培养瓶中培养，培养液及其他培养条件均相同。一段时间后，观察到甲细胞数量比乙细胞数量。

(2)在动物细胞培养时，通常在合成培养基中加入适量血清，其原因是 。

细胞培养应在含5%的CO2的恒温培养箱中进行，CO2的作用是 。

(3)在两种细胞生长过程中，当乙细胞铺满瓶壁时，其生长。药物试验需要大量细胞，两种细胞频繁传代，甲细胞比乙细胞可以传代的次数更。若用动物的肝脏组织块制备肝细胞悬液，需用消化处理。

(4)为了防止细胞培养过程中细菌的污染，可向培养液中加入适量的。

(5)已知癌细胞X基因过量表达与肝肿瘤的发生密切相关，要试验一种抗肿瘤药物Y对甲细胞生长的影响，可将甲细胞分为A、B两组，A组细胞培养液中加入，B组细胞培养液中加入无菌生理盐水，经培养后，从A、B两组收集等量细胞，通过分别检测X基因在A、B两组细胞中的或合成水平的差异，确定Y的药效。

答案 (1)多 (2)血清可以补充合成培养基中缺乏的物质 维持培养液pH (3)停止 多 胰蛋白酶 (4)抗生素 (5)Y mRNA 蛋白质

解析 (1)甲细胞为肝肿瘤细胞，乙细胞为正常肝细胞。肿瘤细胞为无限增殖的细胞，细胞周期短。在相同条件下，培养相同的时间，甲细胞的数量多于乙细胞。(2)动物细胞培养液中必须加入动物血清，血清中含有血清蛋白、生长因子、促进细胞贴壁的因子、激素等合成培养基中缺乏的物质。大多数细胞培养液所需pH在7.2～7.4，而多数培养液靠碳酸氢钠(NaHCO3)与CO2体系进行缓冲，所以二氧化碳的作用是调节培养液pH。(3)甲为肿瘤细胞能无限增殖，传代的次数要比乙细胞多，乙细胞(正常肝细胞)在培养瓶中贴壁生长，当铺满瓶壁时，生长停止。为得到更多的肝细胞，需要定期地用胰蛋白酶使细胞脱离瓶壁，进行传代培养。(4)培养液中加入抗生素来抑制和杀灭微生物，抗生素对动物细胞没有影响。(5)设计一组加入抗癌药物的实验组，一组不加药物的对照组，通过检测药物影响X基因的表达过程，即转录形成mRNA、翻译形成蛋白质的量来检验药效。

5．某研究者用抗原(A)分别免疫3只同种小鼠(X、Y和Z)，每只小鼠免疫5次，每次免疫一周后测定各小鼠血清抗体的效价(能检测出抗原抗体反应的血清最大稀释倍数)，结果如下图所示。

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