课题研究的主要内容：
1 利用现代分离分析技术对八宝景天中有效抑菌成分进行分离，分析。 2 对植物各浸膏进行抑菌实验，筛选活性抑菌物质。 3 对提取物有效成分进行结构鉴定。
4 最终筛选出具有较好抑菌活性物质，即抑菌剂。
筛菌
一 抑菌成分的粗提取
取植物干粉50g，然后按照中药熬制方法(分别加水2000ml、1000ml和1000ml，熬3遍，每遍熬制到200～300ml，3遍滤液合并加热浓缩至500ml)制成水剂，经多层纱布过滤后再经细菌滤器过滤除菌，然后放入冰箱冷藏备用。 二 抑菌实验
（1）生长速率法
提取物对病原真菌菌丝生长抑制作用的测定采用生长速率法，设空白为对照。将提取物用无菌水配制成质量浓度为0.5 g.mL-1 ，0.25 g.mL-1 ，0.2 g.mL-1 ，0.15 g.mL -1，0.125 g.mL-1 ，0.1 g.mL-1 ， 0.05 g.mL-1 ，0.03 g.mL-1 ，0.02 g.mL-1 ，0.01 g.mL-1 ，9个浓度梯度。
在无菌条件下，将供试菌种用0.4cm 的打孔器打出一定数量的菌饼备用[培养好的病原真菌平板用打孔器打成菌片，放入以平板中央，培养5d后以菌片为中心用打孔器打成菌片(主要为了菌龄一致)]，待培养基溶化后，从高浓度到低浓度用吸管吸取1mL提取物，放入培养皿内，然后趁热倒入9mLPDA培养基于9cm 培养皿中制成薄厚均匀的平板，并设不加提取液的为对照。用灭过菌的镊子小心将菌饼放置在含药培养基上，菌丝一面向下，每皿接1块，每一浓度设3皿，然后加盖并标记，置于23℃恒温光照培养箱中培养，待培养72h后取出培养皿（有些生长较快的病菌培养48h），用菌落计数器量菌落直径(十字交叉量取两次，用其平均数)。按下列公式计算抑制率：
菌落直径(cm)=两次直径平均数 - 0.4(菌饼的直径) 对照菌落直径－处理菌落直径
抑制率＝———————————————— ×100% 对照菌落直径 （2）孢子萌发法
对病菌孢子萌发抑制作用的测定采用载玻片法。均用 PDA培养基按照常规方法培养产孢，每种菌置备3个载玻片，并设清水为对照。将提取物制剂与病菌孢子悬浮液混合，使提取物浓度为0.1 g.mL-1 、0.02 g.mL-1 两个浓度梯度，经适当培养后镜检孢子萌发率，以下列公式计算抑制率：
萌发孢子数 孢子萌发率＝——————————×100% 检查总孢子数
对照孢子萌发率-处理孢子萌发率
孢子萌发抑制率＝———————————————— ×100% 对照孢子萌发率
实验方案
一 八宝景天提取物化学成分的分离 1 提取过程
称取干燥粉碎的植物若干kg，过60目筛，用95%的乙醇浸泡2h，提取液经真空减压浓缩回收乙醇溶剂得到八宝景天提取浸膏，如此反复3次，最终得乙醇浸膏若干kg。取若干kg浸膏，用少量水分散，然后依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、水分别萃取3次，各萃取液经真空减压浓缩，回收溶剂，分别得石油醚提取浸膏，氯仿提取浸膏、乙酸乙酯提取浸膏，正丁醇提取浸膏、水溶液提取浸膏。 2 分离步骤
取石油醚醚浸膏g以160一200目硅胶拌样，自然晾干，研细。采用200~300目硅胶湿法上柱，依次用石油醚、石油醚一乙酸乙酷(1:0一0:Iv/v)、乙酸乙酯、 乙酸乙酯一甲醇 (1:O~0:1v/v)进行梯度洗脱，每500ml为一流份，薄层色谱（TLC）跟踪检测，合并相同提取液，再反复经硅胶柱色谱然后配合紫外光谱仪、硫酸显色、等检测方法并通过重结晶纯化手段最终得化合物。
氯仿浸膏、乙酸乙酯浸膏、正丁醇浸膏中化合物的分离同上。
二 抑菌实验
1 抑菌成分的提取分离
同上。以上得到的馏分编号。 2 供试菌株
番茄灰霉病菌、番茄早疫病菌、黄瓜枯萎病菌、黄瓜炭疽病菌、黄瓜菌核病菌、黄瓜白粉病菌、黄瓜霜霉病菌、辣椒疫霉病菌、油菜菌核病菌、；引起瓜类灰霉病、疫病、白粉病、根腐病、枯萎病、菌核病、蔓枯病、苗期猝倒病、立枯病；引起茄果类蔬菜的灰霉病、菌核病、黄萎病、根腐病、枯萎病、绵腐病、绵疫病、褐纹病、细菌性溃疡病、青枯病、髓部坏死病、苗期猝倒病、立枯病等 3 培养基
（1）马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA培养基)
马铃薯(去皮) 200g 葡萄糖 20g 琼脂20g 水1000mL pH值 自然 （2）马铃薯蔗糖琼脂培养基(PSA培养基)
马铃薯(去皮) 200g 蔗糖 20g 琼脂20g 水1000mL pH值 自然
以上两种培养基具体制作方法是：将200g马铃薯去皮，去芽眼，切成小条放入铝锅中，加入1000mL水，煮沸20～30分钟左右至马铃薯软而不烂时，用6～8层纱布过滤，取滤汁于锅中，补水至1000mL，加入琼脂熔化，再加入糖搅拌均匀，趁热分装于试管中。 4化合物抑菌活性测定 （1）生长速率法
提取物对病原真菌菌丝生长抑制作用的测定采用生长速率法，设空白为对照。将提取物用无菌水配制成质量浓度为0.5 g.mL-1 ，0.25 g.mL-1 ，0.2 g.mL-1 ，0.15 g.mL -1，0.125 g.mL-1 ，0.1 g.mL-1 ， 0.05 g.mL-1 ，0.03 g.mL-1 ，0.02 g.mL-1 ，0.01 g.mL-1 ，9个浓度梯度。
在无菌条件下，将供试菌种用0.4cm 的打孔器打出一定数量的菌饼备用[培养好的病原真菌平板用打孔器打成菌片，放入以平板中央，培养5d后以菌片为中心用打孔器打成菌片(主要为了菌龄一致)]，待培养基溶化后，从高浓度到低浓度用吸管吸取1mL提取物，放入培养皿内，然后趁热倒入9mLPDA培养基于9cm 培养皿中制成薄厚均匀的平板，并设不加提取液的为对照。用灭过菌的镊子小心将菌饼放置在含药培养基上，菌丝一面向下，每皿接1块，每一浓度设3皿，然后加盖并标记，置于23℃恒温光照培养箱中培养，待培养72h后取出培养皿（有
些生长较快的病菌培养48h），用菌落计数器量菌落直径(十字交叉量取两次，用其平均数)。按下列公式计算抑制率：
菌落直径(cm)=两次直径平均数 - 0.4(菌饼的直径) 对照菌落直径－处理菌落直径
抑制率＝———————————————— ×100% 对照菌落直径 （2）孢子萌发法
对病菌孢子萌发抑制作用的测定采用载玻片法。均用 PDA培养基按照常规方法培养产孢，每种菌置备3个载玻片，并设清水为对照。将提取物制剂与病菌孢子悬浮液混合，使提取物浓度为0.1 g.mL-1 、0.02 g.mL-1 两个浓度梯度，经适当培养后镜检孢子萌发率，以下列公式计算抑制率：
萌发孢子数 孢子萌发率＝——————————×100% 检查总孢子数
对照孢子萌发率-处理孢子萌发率
孢子萌发抑制率＝———————————————— ×100% 对照孢子萌发率
对合并的各馏分分别进行活性测定，对活性较好的馏分进行2次硅胶柱层析及HPLC分离纯化，最终得到活性单体化合物。HPLC色谱条件为色谱柱：Hypersil C18柱(10μm，20.0 mm×250 mm)，流动相：甲醇-水(体积比6∶4)，检测波长240 nm，流速为6 mL/min。
抑制细菌活性实验
采用圆形纸片扩散法。分别刮取供试菌菌苔一环于5mL无菌水中，摇匀菌悬液 (浓度约为106个/mL)，倒入熔化并冷却至40℃~50℃的培养基中，摇匀后，迅速分装于培养皿(φ90mm)中，待凝固后备用。取已消毒过的双层圆形滤纸片(φ6mm)浸取药液(约20ul)，略干后平贴于培养基平板上，同时用溶剂做空白对照。置恒温培养箱中培养(36℃~37℃，18h一24h)后分别观察结果，测量抑菌圈。以上步骤均按无菌条件操作，每个处理设3个平行样，结果取平均值。