抑制真菌活性实验 采用菌丝生长速率法:

(l)菌饼制备:取保存的真菌菌种，接种于孟加拉红培养基上，于30℃下培养3一4d至菌丝长满全皿。用直径为1.ocm的打孔器制成若干菌饼备用。 (2)含药培养基平板制备:准确将lmL药液涂布PDA培养基上制成含药培养基 平板，在对照上则涂布相同体积的溶剂。

(3)抑制实验:在培养好的供试菌平板上，用接种针挑取菌饼轻放于含药培养基平板中央(有菌丝的一面向下)，每培养皿放置1个菌饼。每处理重复3一4次。28士2℃下培养一段时间后检查各处理菌落的直径，按以下公式计算不同处理对供试菌的菌丝生长抑制率。菌丝生长抑制率(%)=(对照菌落直径一处理菌落直径)/(对照菌落直径一菌饼直径 )X100%

抑制细菌活性测定

96孔板微量稀释法：将供试样品以DMSO溶解再以水稀释至4000 mg/L的质量浓度，以此质量浓度进行2倍稀释，以无菌水做阴性对照。无菌培养液和2.5%DMSO溶液为空白对照，以硫酸链霉素作为阳性对照。微孔板震荡混合后，置于37℃培养箱内培养18 h后观察结果，肉汤没有浑浊的孔中的最低药液质量浓度为样品对供试细菌的最低抑菌质量浓度(MIC)，取没有混浊的孔中的肉汤，接种于未加药的培养基平板上，37℃培养12 h后取出观察，没有细菌生长的最低药液质量浓度为样品对供试菌的最低杀菌质量浓度(MBC)。所有活性测定均重复3次。

单因素实验

影响加杨叶中类胡萝卜素提取的因素较多，如:提取溶剂浓度、液料比、温度、 时间等。首先，我们采用单因素实验考察各种因素对提取率的影响，单因素每次实验重复3次，计算重复实验结果的均值、标准差和方差，同时分析了单因素不同水平对实验结果的影响。 (l)提取溶剂的选择

类胡萝卜素是脂溶性色素，可溶于丙酮、石油醚、无水乙醇、乙酸乙醋等(何兰， 2008)。考虑到石油醚具有价格经济，提取液色素干扰小等优点，本文采用石油

醚为提取溶剂。 (2)超声时间的选择

在液料比为30:1，超声功率200W，超声提取温度25℃，超声1次的条件下， 不同超声时间对加杨叶中总类胡萝卜素得率的影响如图2一2所示。

由图2一2可以看出，随着超声时间的延长，提取率逐渐增大，超过25min后， 提取率有所下降。考虑到类胡萝卜素的不稳定因素，提取成本也会增加，提取过程应尽量在较短时间内完成，实验中超声时间选取25min。 (3)不同超声功率对提取率的影响

在25℃、液料比30:1、提取次数1、超声时间为25min的条件下，不同超声功 率对提取结果的影响如图2一3。图2一3可以看出，超声功率在400w内，超声功率与总类胡萝卜素得率呈一定的正向关系，原因主要在于在超声场中，声波可以产生空穴效应，在剧烈的振动下，细胞壁和细胞膜破碎，从而促进物质扩散，一般来说，超声强度与提取率成正比关系;当超声功率为500W时，得率则下降。原因是过高的超声功率会对类胡萝卜素分子产生一定的破坏作用(李洋等，2008)。故实验选择超声功率40ow。 (4)不同液料比对提取率的影响

在25℃、超声功率400W、超声时间25min、提取1次的条件下，不同液料比对 提取得率的影响如图2一4所示。图2一4表明，加杨叶中总类胡萝卜素得率随着液料比的增高而提高，当液料比大于40:1时，得率基本稳定，主要是因为浸取过程中当包容与固体的溶液的溶质浓度和浸出液溶质浓度相等时，浸取达到平衡。因此实验中选择提取率较大时的液料比40:l。 (5)不同温度对提取率的影响

在超声功率400W、超声时间25min、液料比40:1、提取次数1的条件下，不 同温度对总类胡萝卜素得率的影响如图2一5所示。

由图5可以看出，超声温度在25℃一55℃时，随着温度的升高，提取率明显增大，这主要是因为温度的提高能够增加化合物的溶解性和扩散速率，减小溶剂的勃度，使其可以容易的穿透组织，改善提取效率(张东明，2009);当温度大于55℃时提取率降低显著。这可能是由于类胡萝卜素长时间在较高温度下不稳定或结构发生变化的缘故(黄文等，2001)。实验中选择55℃进行提取。 (6)不同提取次数对提取率的影响

在55℃、超声功率 400w、超声时间25min、液料比40:1的条件下，分别采用

不同超声提取次数来提取加杨叶中总类胡萝卜素，结果如图2一6。

由图2一6可知，得率随着超声提取次数的增加而增大，但样品中所含提取物的量是固定，因此得率的增加是有限的。另外提取次数的增加会使提取成本和提取时间增加，实验选择提取2次。 2.3.4.3超声波提取正交试验分析 (l)正交试验结果分析

采用场L9(34)正交表，以总类胡萝卜素含量为考察指标，对超声波提取加杨叶中类胡萝卜素的工艺进行研究。正交实验及正交实验方差分析见表2一6。 结果表明:以石油醚为提取溶剂，在提取2次的条件下，根据表2一6中极差分析结果可知各因素对类胡萝卜素得率的影响顺序为D>A>C>B，即超声温度>液料比>超声功率>超声时间，其最佳水平组AZB3C3D3，即液料比40:1、超声时间3Omin、超声功率soow，超声温度55℃。同时表2一7中方差分析结果表明，超声温度对提取率的影响最为显著。 (2)重复性实验

取相同样品5份，以最佳工艺进行5次平行实验。结果如表2一8所示:RSD为 2.82%，结果重现性好，该方法稳定可行。 (3)精密度实验

以最佳提取工艺制备提取液，分别取5份相同的提取液测定吸光度后计算总类胡 萝卜素的含量。从表2一9可以看出该方法测定加杨叶中总类胡萝卜素含量，相对标准偏差较小，精密度较高，所得数据精确。 2.4结论

本研究通过单因素及正交试验，得出4因素对黄酮得率的影响从大到小依次是温 度>液料比>乙醇浓度>提取时间。方差分析也表明:超声温度对总类胡萝卜素得率 有显著影响。确定了超声波法以石油醚为提取溶剂提取加杨叶中总类胡萝卜素的最佳工艺参数:超声波功率为500W，液料比40:1，在55℃下提取2次，每次超声3伽min的条件下提取率最高为50.57m岁1009。其重复性试验RsD为1.03%，表明重现性良好;精密度试验RSD为0.34%，表明精密度良好。

一 抑菌物质粗提取

准确称取100 g的样品（叶，茎，花），于250 ml锥形瓶中，加入200 ml 95%的乙醇，室温下，超声提取45 min，连续提取3次，过滤粗提物，离心（3500 r/min,20 min），过滤除杂，滤液用旋转蒸发仪浓缩至干，4 ℃冰箱中保存备用。 二 筛菌试验 1 PDA培养基制备

将200g马铃薯去皮，去芽眼，切成小条放入铝锅中，加入1000mL水，煮沸20～30分钟左右至马铃薯软而不烂时，用6～8层纱布过滤，取滤汁于锅中，补水至1000mL，加入琼脂熔化，再加入葡萄糖搅拌均匀，趁热倒入锥形瓶中备用。 2 菌的活化

取培养基灭菌，乘热倒入若干灭菌的培养皿中，使培养基盖过培养皿底部。将供试真菌从4 ℃冰箱取出，在无菌环境下接种于培养皿中，于28℃恒温培养箱中活化培养，待菌丝长满整个培养皿时，用直径为1.ocm的打孔器制成若干菌饼备用。

4 含药培养基平板制备

取5g以上制备的提取物于250ml锥形瓶中，无菌水配制成质量浓度为0.5 g.mL-1 ，0.4 g.mL-1 ，0.3 g.mL-1 ，0.2 g.mL -1，0.1 g.mL-1 5个浓度梯度。准确量取以上各浓度提取液l mL于PDA培养基上制成含药培养基平板，在对照上则涂布相同体积的无菌水。每个浓度做3个培养皿。 5 抑菌实验

在培养好的供试菌平板上，用接种针挑取菌饼轻放于含药培养基平板中央(有菌丝的一面向下)，每培养皿放置1个菌饼。每处理重复3次。28士2℃下培养一段时间后检查各处理菌落的直径，按以下公式计算不同处理对供试菌的菌丝生长抑制率。菌丝生长抑制率(%)=(对照菌落直径一处理菌落直径)/(对照菌落直径一菌饼直径 )×100%