分子诊断学习题 Lucas Gu
A 100～200个核苷酸 B 200～300个核苷酸 C 300～500个核苷酸 D 500～700个核苷酸 E 任意长度均可
5.要能够获得良好的电泳带谱模式，使得DNA 条带分离效果较佳，反应试管中ddNTP和dNTP的比例通常为：（ B ） A 1：5 B 1：10 C 1：15 D 1：20 E 1：25
6. DNA自动化测序系统中，最常用的标记物是（ A ） A 荧光染料 B α-32P C γ-32P D 生物素 E 35S
二、X型题
1．化学法测序反应体系的组成中包括有（A B D） A待测DNA
B待测DNA样品的末端标记 C绝对单一碱基特异性的化学裂解 D电泳测序图谱的识读 E 引物
2．链末端终止法测序反应体系的组成中包括有（A B C D E） A待测模板链 B引物 C DNA聚合酶
D放射性核素标记的dNTP E测序产物的凝胶电泳及识读
3．DNA序列测定的应用有（A B C D E） A 分析基因组核苷酸排列序列 B 分析基因序列 C 基因定点诱变的基础
D 基因工程载体构建中DNA序列定位和排序的基础 E 临床疾病的分子诊断
4．Sanger双脱氧链终止法采用DNA引物引导新生DNA的合成，采用的模板是（ A B ） A 单链DNA B 双链DNA C 单链RNA D 双链RNA E 蛋白质
三、名词解释
2． 毛细管凝胶电泳（Capillary gel electrophoresis, CGE）
答：是将平板电泳的凝胶移到毛细管中做支持物进行电泳，由于电场强度比板凝胶电泳大大提高，使分离时间缩短约25倍。 2．DNA杂交测序法(Sequencing by hybridization, SBH) 答：是利用杂交技术来测定DNA序列的方法。其基本原理是用一套已知序列、长度特异、具有所有可能的碱基序列的寡核苷酸探针，与未知序列的待测DNA片段进行分子杂交，然后根据寡核苷酸探针完全杂交互补的情况推知待测DNA的碱基序列。 3．引物步入法（primer walking ）
答：是从待测DNA片段的3ˊ端开始，利用载体上的序列设计第一次反应的引物，测定一段DNA序列，然后依次根据前一次测序结果，设计下一次反应引物，循序渐进测序，直至完成，得到靶DNA的全部序列
4．焦磷酸测序技术（pyrosequencing）
答：是在以靶DNA链为模板指导核酸合成的过程中，以释放荧光为检测信号，从而对靶DNA链进行实时测序的方法。 四、问答题
1．简述链末端终止法测定 DNA 序列的原理
答：利用DNA聚合酶，以待测单链DNA为模板，以dNTP为底物，设立四种相互独立的测序反应体系，在每个反应体系中加入不同的双脱氧核苷三磷酸（dideoxyribonucleoside triphosphate，ddNTP）作为链延伸终止剂，在测序引物引导下，按照碱基配对原则，每个反应体系中合成一系列长短不一的引物延伸链，通过高分辨率的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，放射自显影检测后，从凝胶底部到顶部按5′→3′方向读出新合成链序列，由此推知待测模板链的序列。 2. 简述化学法测定 DNA序列的基本原理
答：化学法是对待测DNA进行化学降解。在化学法的测序系统中，先对待测DNA末端进行放射性标记，然后分成4组或5组互为独立的化学反应体系，每一组用不同的化学试剂特异地针对某一种或某一类碱基进行化学切割，通过化学降解后产生长短不一的DNA片段，其长度取决于改组反应所针对的碱基在待测DNA片断中的位置，将各组反应产物通过高分辨率的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，放射自显影检测后直接识读待测DNA的序列。
生物芯片技术
一、选择题
1. 下面哪种生物芯片不属于微阵列芯片 ( ) A. 基因芯片 B. 蛋白芯片 C. PCR反应芯片 D. 芯片实验室
2. 生物芯片的主要特点是 ( ) A. 高通量 B. 微型化 C. 集成化 D. 并行化
3. 下面哪些方法属于基因芯片原位合成技术（ ） 分子诊断学习题 Lucas Gu
A. 原位光刻合成 B. 合成点样 C. 压电打印 D. 分子印章
二、名词解释 1. 基因芯片 2. 蛋白芯片 3. 微缩芯片实验室
三、简答题
1. 试述生物芯片的种类及主要功能。 2. 试述基因芯片的工作原理及制备。 3. 简述蛋白芯片的原理及应用。
4. 举例说明基因芯片在临床诊断中的应用。
第11章答案： 一、选择题 1. C
2. A、B、C、D 3. A、C、D 二、名词解释 1. 基因芯片
将大量的基因片段有序地、高密度地排列在玻璃片或纤维膜等载体上，称之为基因芯片(gene chip)，又称DNA芯片(DNA chip)或DNA微阵列(DNA micro-array)。基因芯片技术是建立在基因探针和杂交测序技术上的一种高效、快速的核酸序列分析手段。它是将大量探针分子固定于支持物上，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号的强度及分布来进行基因的分析。在一块1cm2大小的基因芯片上，根据需要可固定数以千计甚至万计的基因，以此形成一个密集的基因方阵，实现对千万个基因的同步检测。
2. 蛋白芯片
蛋白质芯片（protein chip），又称蛋白质微阵列(protein microarray)，是用于蛋白质功能研究及相互作用分析的生物芯片，采用原位合成、机械点样或共价结合的等方法将多肽、蛋白、酶、抗原、抗体固定于硅片、玻璃片、塑料片、凝胶、尼龙膜等固相介质上形成的生物分子点阵。在待分析样品中的生物分子与蛋白质芯片的探针分子发生杂交或相互作用或其他分离方式分离后，利用激光共聚焦显微扫描仪对杂交信号进行高通量检测和分析。蛋白质芯片是将整个蛋白质水平的相关生化分析过程集成于芯片表面，从而实现对多肽、蛋白质及其他生物成份进行高通量检测。
3. 微缩芯片实验室
芯片实验室是将样品制备、生化反应和检测分析的全过程集约化，并缩微到一张芯片上自动完成，形成的所谓微型全分析系
统（micro total analysis systen,μ-TAS）,或称“缩微芯片实验室”（lab-on-a-chip）。
三、简答题
1. 试述生物芯片的种类及主要功能。
生物芯片根据其结构特点，可以将生物芯片分为微阵列芯片和微流体芯片两个主要类别。微阵列芯片是由生物材料微阵列构成的芯片，包括基因芯片、蛋白质芯片、细胞芯片和组织芯片等，由于它们的工作原理都是基于生物分子之间的亲和结合作用，如核酸分子的碱基配对作用，抗原和抗体的结合等，所以通常也称为亲和生物芯片。微流芯片是以各种微结构为基础的芯片，利用它可实现对各种生化组分的微流控操作和分析，这类芯片的代表有毛细管电泳芯片、PCR反应芯片、介电电泳芯片等。生物芯片发展的最终目标是将各种生物化学分析操作的整个过程，从样品制备、生化反应到结果检测，都集成化并缩微到芯片上自动完成，以获得所谓的微型全分析系统（micro total analysis systen,μ-TAS）,或称“微缩芯片实验室”（lab-on-a-chip）。微缩芯片实验室代表了生物芯片技术发展的未来。
2. 试述基因芯片的工作原理及制备。
基因芯片技术是建立在基因探针和杂交测序技术上的一种高效、快速的核酸序列分析手段。它将大量探针分子固定于支持物上，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号的强度及分布来进行分析。在一块1cm2大小的基因芯片上，根据需要可固定数以千计甚至万计的基因，以此形成一个密集的基因方阵，实现对千万个基因的同步检测。基因芯片技术主要包括四个主要步骤：芯片制备、样品制备、杂交反应和信号检测以及结果分析。
3. 简述蛋白芯片的原理及应用。
蛋白质芯片的基本原理是采用原位合成、机械点样或共价结合的等方法将多肽、蛋白、酶、抗原、抗体固定于固相介质上形成的生物分子点阵，在待分析样品中的生物分子与蛋白质芯片的探针分子发生杂交或相互作用或其他分离方式分离后，利用激光共聚焦显微扫描仪对杂交信号进行高通量检测和分析。蛋白质芯片是将整个蛋白质水平的相关生化分析过程集成于芯片表面，从而实现对多肽、蛋白质及其他生物成份进行高通量检测。
蛋白质芯片技术是一种快捷、高效、高通量、并行、微型化和自动化的蛋白质分析技术，适用于分析包括组织、细胞系、体液在内的多种生物样品能分析包含针对信号传导、癌症、细胞周期调控、细胞结构、凋亡和神经生物学等广泛的生物功能的相关蛋白，灵敏度高达pg/ml。
4. 举例说明基因芯片在临床诊断中的应用。
基因芯片作为一项现代化的诊断新技术在感染性疾病、遗传性疾病的诊断和耐药性检测等方面已显示出良好的应用前景。下面举例说明基因芯片在疾病诊断的应用。
（1）感染性疾病的诊断 性传播疾病、肝炎等。
分子诊断学习题 Lucas Gu
（2）遗传性疾病的诊断
地中海贫血、血友病、婚前检查等。 （3）耐药性检测
结核分支杆菌耐药性检测芯片等。
其它的分子诊断检测方法
一、A型题
1．PCR扩增阻碍突变系统检测突变的原理是基于 A 由于突变，限制性内切酶识别位点变化，不能被切开 B 由于突变，电泳迁移率发生变化
C 连接酶不能连接与靶序列错配的两个DNA片段 D Taq酶不能延伸3’末端与靶序列错配的引物 E 以上都不是
2．利用寡核苷酸连接实验检测双等位基因变异时需要 A 1个探针 B 2个探针 C 3个探针 D 4个探针 E 5个探针
3．T4 DNA连接酶或Tth DNA连接酶更容易识别哪类错配 A 连接缺口上游探针的5’末端 B 连接缺口上游探针的3’末端 C 连接缺口下游探针的5’末端 D 连接缺口下游探针的3’末端 E 以上都不是
4．温度梯度凝胶电泳能够检测的突变一般位于DNA片段上哪个区域
A 较低解链温度的“解链区域” B 最低解链温度的“解链区域” C 较高解链温度的“解链区域” D 最高解链温度的“解链区域” E 所有位点
5．温度梯度凝胶电泳与变性梯度凝胶电泳检测基因变异是基于 A 变异单链DNA分子的电泳迁移率不同 B 变异DNA双链分子的电泳迁移率不同
C 变异双链DNA分子部分变性的条件不同，电泳迁移率改变的位置不同
D 变异双链DNA分子完全变性的条件不同，电泳迁移率改变的位置不同
E 变异双链DNA分子完全变性的条件不同，电泳迁移率不同 6．蛋白质截短测试法与其它分子检测方法最大的不同在于 A 只检测单位点突变 B 只检测已知突变
C 只检测与疾病相关的突变 D 可检测未知突变 E 可检测多位点突变
二、X型题
1．PCR扩增阻碍突变系统检测可用于哪些类型的分子检测 A 单位点突变 B 多位点突变 C 未知突变 D 基因分型 E 以上都可以
2．耐热连接酶的使用，可增加寡核苷酸连接实验的 A 灵敏度 B 重现性 C 特异性 D 假阳性 E 假阴性
3．变性高效液相色谱法可分离 A 单链DNA分子 B 双链DNA分子 C 环状DNA分子 D 超螺旋DNA分子 E 部分双链DNA分子
4．脉冲场凝胶电泳与传统凝胶电泳的不同点有 A 采用的凝胶基质不同 B 采用的电场类型不同 C 采用的电泳仪装置不同 D 分辨的DNA片段大小不同 E 样品的制备不同
5．下列哪些技术属于分子影像技术 A Ultrasound B SPECT C MRI D CT E PET
三、名词解释 1．解链区域
2．变性高效液相色谱法
3．倒转电场凝胶电泳（Field-Inversion Gel Electrophoresis, FIGE）
4．旋转凝胶电泳（Rotating Gel Electrophoresis, RGE） 5．分子影像探针 四、问答题
1．简述TGGE/DGGE的基本原理
2．简述变性高效液相色谱法检测基因变异的优点 3．试述PTT检测基因变异的优缺点 4．简述PFGE的基本原理
5．简述分子影像在分子诊断中的应用 6．简述常用的光学成像技术
分子诊断学习题 Lucas Gu
第十章 核酸测序技术试题答案
一、A型题
1.D 2.C 3.B 4.A 5.D 6.C 二、X型题
1.ABD 2.AC 3.ABE 4.BCDE 5.BCE 三、名词解释 1． 解链区域
答：一个DNA分子一般含有多个“解链区域”，一个“解链区域”长大约50－300bp不等，每一个“解链区域”内的所有核苷酸在其相应的Tm范围内以“全或无”的方式发生解离。在进行TGGE时，当DNA分子到达其第一个“解链区域”的解链温度时，分子的电泳迁移率将急剧降低。若该区域有碱基突变，突变将改变这一“解链区域”的Tm，因此，同时进行TGGE时，由于变异分子的第一个“解链区域”Tm不同，其电泳迁移率改变的凝胶位置不同，可形成不同的条带，从而可分辨出基因的变异。
2． 变性高效液相色谱法
答：DHPLC的填料由一个具有惰性物化性质的固定相和PS-DVB微孔球共价连接而成，采用具有疏水性的又带正电荷的TEAA作为“桥分子”，使DNA片段能够被吸附在固定相上。DHPLC的流动相为有机溶剂乙氰，双链DNA分子被吸附在固定相上，通过改变流动相中乙氰的浓度，不同片段长度的DNA分子被逐步洗脱，从而实现DNA片段的分离。洗脱下来的DNA片段一般通过紫外检测，波长254nm，而不需要进行费时的凝胶电泳分析。
当柱温<50℃时，根据双链DNA分子的链长度来的分离。当70℃>柱温>50℃时，根据双链分子的序列进行分离，这时可用于杂合双链分子与纯合双链分子的分离。当柱温>70℃时，依据单链DNA分子的碱基组成和片段长短进行分离。
3． 倒转电场凝胶电泳（Field-Inversion Gel Electrophoresis,
FIGE）
答：FIGE的两个电场方向为180°反转。电场的方向间隔一定时间交换，驱动DNA分子向前迁移的正向脉冲时间较反向的长一些，这样DNA分子的总迁移为向前。其时间比例为向前：向后＝3：1。在FIGE试验中通过持续改变脉冲时程，利用简单的装置可就可得到分离很好的电泳条带，所需的仅为标准的凝胶电泳槽和一个脉冲电极控制器。目前FIGE已非常流行于较小片段的分离，分离的片段最大为800kb（600－750kb）。
4． 旋转凝胶电泳（Rotating Gel Electrophoresis, RGE）
答：RGE采用一个单独的均一电场，只是通过周期性的旋转凝胶而使得电场方向相对改变，从而使DNA分子也是在周期性改变的电场中泳动，其分离原理与其它的PFGE一样。在RGE中，骤变脉冲时间和电压很容易，因而可以用于研究不同电场角度时这些参数对DNA分离效果的影响。通过适当调节凝胶旋转频率，RGE可分离50－6,000kb的DNA分子。 5． 分子影像探针
答：分子探针是分子影像中的关键组成部分，高度特异性的
分子探针是进行分子影像学研究的先决条件，常用的示踪剂为有核素、顺磁性物质或荧光素等，应具备下列特点：
（1）分子量小、纯度高、安全，不影响所研究的疾病过程。 （2）具有良好的生物学功能，能参与人体正常的生理生化活动。
（3）能够克服人体内部的“生理屏障” （如脑屏障、血管壁、细胞膜等），顺利到达靶分子所在的器官，同时不会积聚于其他组织。
（4）示踪剂、分子探针和靶分子应该紧密结合，不能脱落，且有足够长的半衰期以便于检测。 四、问答题
1． 简述TGGE/DGGE的基本原理
答：在TGGE中，随着温度的逐渐升高时，DNA分子会呈阶梯式逐步发生解链。部分解链的双链DNA分子表现出一种复杂的分枝构像，使得其电泳迁移率大大下降。DNA分子的解链决定于该分子的解链温度（Tm），而Tm有强烈的序列依赖性，如在单取代突变中，若是A:T（两个氢键）被G:C（三个氢键）取代，将增加该双链DNA分子的Tm值。而整个DNA分子序列对解链温度也有影响，若A:T被T:A替代，或G:C被C:G替代，分子的解链温度也会发生改变。因此不同的DNA分子由于其Tm不同，将于不同凝胶位置（温度不同）产生分枝（解离）使电泳迁移率降低，从而在凝胶上的不同位置形成条带。
DGGE的变性条件为热（一般为60℃的恒定温度）和固定比率的甲酰胺（0－40％）、尿素（0－7M）。这些梯度变性的功能就相当于TGGE中的温度梯度的功能，使不同DNA分子在不同的凝胶部位发生解链，引起迁移率下降，从而将不同的DNA分子分离。
2． 简述变性高效液相色谱法检测基因变异的优点
答：DHPLC突变检测技术与其它方法相比，具有更高的准确性和敏感性。
（1）DHPLC与各种电泳法的比较 SSCP 分析片段长度<300 bp，对于人类SNP的检出率为50～95％，尤其容易漏检位于发夹结构中的变异。CSGE检测杂合子的灵敏度与SSCP相当或稍低。而DHPLC对150bp~600bp的DNA片段的突变检出率都可达到100％，且而不需要特殊的样本处理。TGGE/DGGE对于异源双链及同源双链分子的检测灵敏度高出CSGE和SSCP很多。但对于较高温度的融解区域的突变检测，DHPLC的灵敏度要高于TGGE/DGGE。
（2）DHPLC与DNA测序的比较 对于频率高于20%的变异，直接测序的检出率为80％，DHPLC的检出率可达到100％；基因突变频率低于20%时就很难用测序方法检测到，而DHPLC可从待检样品中检测到占总基因量0.5-5%的突变等位基因，且重现性很好。
3． 试述PTT检测基因变异的优缺点
答：PTT检测突变的优点：①能检测出只与疾病相关的蛋白截短突变；②可检测出在RNA形成过程中发生的突变（如剪接突变）；③通过只鉴定引起疾病截短突变，PTT分析不会受到基因沉默变异如多态性的妨碍；④截短蛋白分子的长度指明了突变