生物技术制药

1优点:不存在基因的非特异性激活或抑制;可严格调控基因表达;真核蛋白○

在表达时方便、高速、有效、易得

2缺点: 缺乏翻译后加工机制,不能折叠和糖基化; ○

融合蛋白易生成包涵体,复性后才有活性; 很难表达大量的可溶性蛋白

1化学合成法○2.基因组DNA文库○3.cDNA文库 (逆转录法)○4.聚合15. 目的基因制备方法:○

酶链式反应(PCR)

16. 分子杂交(碱基互补配对):基因文库、CDNA文库 17. PCR

(1) 定义:是用一对寡聚DNA作为引物,通过加温变性(30s) →退火(30

s)→延伸(1min)的多次循环,使目的基因得到特异性扩增

1DNA半保留复制的机理○2体外DNA分子于不同温度下可变性和复性的(2) 原理:○

性质

(3) 物料:4种dNTP、引物、模板DNA、Taq DNA聚合酶、Mg2+ (4) 过程:高温变性、低温退火(复性)及适温延伸

① 模板DNA的变性:模板DNA经加热至94℃左右30s后,使模板DNA双

链解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备

②模板DNA与引物的退火(复性):模板DNA经加热变性成单链后,温度降

至40~60(55)℃左右30s,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合(退火温度与时间,取决于引物的长度、碱基组成及其浓度,还有靶基因序列的长度)

③引物的延伸:在Taq酶(在72℃左右1min)的作用下,以dNTP为原

料,从引物的5′端→3′端延伸,合成与模板互补的DNA链。 Tm(解链温度)=4(G+C)+2(A+T) 复性温度=Tm值-(5-10℃) 1kb的DNA片段延伸时间1min

(5) 特点:特异性强、灵敏度高、简便、快捷、对标本的纯度要求低 18. 三个基本原件:载体、宿主细胞、目的基因

19. 多克隆位点:是包含多个限制性酶切位点的一段很短的DNA序列,是外源基因插入的

位置

20. DNA复制起点:发生复制的单个DNA单元称为复制子,每个复制子在每次细胞分裂期

只发动一次复制事件,复制子有控制启动复制的元件,称为复制起点

21. 核糖体结合位点(RBS):mRNA的起始AUG上游约8~13核苷酸处。存在一段由

4~9个核苷酸组成的共有序列(SD序列)-AGGAGG-,可被16SrRNA通过碱基互补精确识别。这段序列被称为核糖体结合位点。

1SD顺序与16srRNA3’末端互补程度 UAAGGAGG的SD序列比AAGGA的○

SD序列能使蛋白质的产量提高3——6倍

2AUG-SD间的距离 5-13bp ○

22. 核酸凝胶电泳:核酸凝胶电泳是分子克隆核心技术之一,用于分离、鉴定和纯化DNA

或RNA片段

(1) 主要检测:分子量、DNA浓度

(2) 原理:DNA分子带负电,向正极移动;分子量小的跑的快,分子量大的跑的慢 (3) 琼脂糖凝胶电泳

1琼脂糖种类: 常见的有两种:标准琼脂糖和低熔点琼脂糖 ○

2凝胶载样缓冲液:临上样到凝胶加样孔之前与待电泳的样品相混合的一种缓冲液 ○

主要成分:溴酚蓝/二甲苯青FF 40%蔗糖

3染色与摄影:主要有溴化乙锭(EB)染色法和 SYBR Gold染色法 ○

4DNA迁移率的影响因素:DNA分子的大小(成反比) ○、琼脂糖浓度、DNA的构

像、凝胶和电泳缓冲液中的溴化乙锭、所用电压、琼脂糖种类、电泳缓冲液

23. 目的基因的重组:

(1) 本质:DNA片段之间的体外连接 (2) 载体的选择:

a) 质粒:可用于细菌细胞内独立复制,有的亦可用于动、植物细胞。 b) 噬菌体:经构建后,常用于细菌细胞。 c) 病毒:常用作动物细胞基因工程的载体

(3) DNA分子的体外连接:粘性末端连接、平端连接、人工接头法、同聚物结尾法 (4) 将重组DNA导入宿主细胞:重组体DNA分子只有导入合适的受体细胞,才

能进行大量的复制,扩增和表达(感受态细胞的制备、连接产物的转化) a) 转化:制备感受态细胞→冷的氯化钙处理,细胞处于最适摄取和容忍外来

DNA的生理状态

b) 感受态细胞:细胞处于最适摄取和容忍外来DNA的生理状态

1大肠杆菌结合交配期染色体标记的单向转移○2可整合到宿主染色体中 24. F质粒:○

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